多組學分析揭示疤痕和再生傷口愈合過程中不同的分子事件（一）
多組學分析揭示疤痕和再生傷口——愈合過程中不同的分子事件
再生是組織修復的關鍵，但皮膚損傷通常會產(chǎn)生纖維化的、無功能的疤痕。開發(fā)促進再生的療法需要嚴格了解從損傷到纖維化或再生的分子進展。在此，研究者在轉(zhuǎn)錄（單細胞RNA測序）、蛋白質(zhì)（TIMSTOF蛋白質(zhì)組學）和組織（細胞外基質(zhì)超微結(jié)構(gòu)分析）水平上對瘢痕與YAP抑制誘導的傷口再生進行分析。結(jié)果顯示，破壞YAP的機械傳導，可以通過激活Trps1和Wnt信號的成纖維細胞產(chǎn)生再生修復。他們也通過體內(nèi)基因敲除和在傷口中過表達進行驗證，確定Trps1是一個關鍵的調(diào)節(jié)基因。該研究的發(fā)現(xiàn)作為傷口再生的多組學圖譜，對病理性纖維化有治療性意義。
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文章詳情
文章題目：Multi-omic analysis reveals divergent molecular events in scarring and regenerative wound healing
中文題目：多組學分析揭示了疤痕和再生傷口愈合過程中不同的分子事件
見刊時間：2022.02
期刊名稱：Cell Stem Cell
影響因子：25.269
實驗平臺：scRNA-seq (10X Genomics)、蛋白質(zhì)組學（TIMSTOF）
DOI：10.1016/j.stem.2021.12.011
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研究內(nèi)容
1、纖維性和再生性傷口的多模式分析
由于損傷修復包括多個階段，因此隨著時間的推移，研究愈合的細胞和分子動力學是至關重要的。研究者在7個時間點分析了小鼠傷口和小鼠皮膚：UW皮膚，術后第一天(POD) 2(炎癥)，POD 7(成纖維細胞增殖)，POD 10，POD 14(傷口重新上皮化，成纖維細胞產(chǎn)生ECM)，POD 21和POD 30(成纖維細胞重塑ECM)。研究者使用了夾板切除傷口模型，從而誘導類似人類的愈合動力學。傷后立即在創(chuàng)面上注射維替泊芬或載藥(磷酸鹽緩沖生理鹽水[PBS])對照。對照組創(chuàng)面形成明顯的纖維疤痕，基本上是裸露的區(qū)域，有致密的、線性排列的ECM纖維，沒有次生元素(HF，腺體)；相反，到POD 30時，維他泊芬處理的傷口再生的HF和腺體水平與UW皮膚相當，并有更低密度、更隨機定向的ECM纖維(圖1A)。證實再生不反映維替泊芬的脫靶效應，通過En-1成纖維細胞系靶向YAP敲除觀察到類似的表型。
為了研究再生和纖維化傷口的細胞和分子動力學，研究者從5個關鍵時間點(UW、POD 2、7、14和30)分別損傷并分析5只小鼠(2個傷口池/只老鼠)和治療條件(對照組，維替泊芬;圖1 B)。每只小鼠三分之一的組織用于組織學檢查，其余進行細胞分類，以分離成纖維細胞(Lin−)和其他細胞(主要是免疫細胞;Lin+)。一半的細胞進行蛋白質(zhì)組學分析:從每只小鼠的Lin -和Lin+細胞中純化的多肽進行timsTOF質(zhì)譜。其余細胞進行scRNA-seq，每個樣本都帶有標簽寡核苷酸(HTO)，使scRNA-seq細胞與來自同一只小鼠的蛋白質(zhì)組學和組織學樣本相連接。
研究者通過scRNA-seq共分析了2,986個細胞，并對細胞進行了聚類 (圖1C)。結(jié)果顯示，維替泊芬治療的傷口成纖維細胞適度增加，但對照組和維替泊芬傷口的細胞比例大體相似(圖1D)，這表明維替泊芬可能通過改變細胞表型而不是相對表現(xiàn)(或通過改變細胞類型中亞群的表現(xiàn))來誘導再生。隨后研究者做了timsTOF 4D蛋白組學分析 (圖1E)，并表明蛋白組分析可以在更廣泛的修復動態(tài)中捕獲連貫的纖維化變化。最后，由于ECM結(jié)構(gòu)/組織是物理組織特性的關鍵決定因素，他們使用新開發(fā)的圖像處理算法對損傷皮膚和UW皮膚的ECM超微結(jié)構(gòu)進行了量化(圖1F上)。結(jié)果表明，隨著時間的推移，對照傷口的ECM與UW的ECM顯著不同(圖1F左下)，證明了纖維化瘢痕。相比之下，POD 14/30維替泊芬傷口與UW皮膚重疊(圖1F，右下)，表明維替泊芬治療后的愈合產(chǎn)生了UW樣ECM。無論是哪種處理，POD 7-14之間的差異最大，這與ECM沉積主要發(fā)生在這段時間一致。
2、識別修復的分子軌跡
在建立了通過scRNA-seq、蛋白質(zhì)組學和ECM超微結(jié)構(gòu)分析分析傷口動力學的能力后，研究者試圖應用這些方法來確定再生和纖維化的不同機制。由于成纖維細胞是高度機械敏感性的，也是瘢痕形成的主要驅(qū)動因素，他們假設維替泊芬通過改變成纖維細胞表型來促進再生，并將scRNA-seq分析聚焦于成纖維細胞。他們做了細胞軌跡分析 (圖2A)。由此產(chǎn)生的軌跡有兩個分叉的分支，早期(POD 2)損傷的成纖維細胞靠近分支點，晚期損傷的成纖維細胞位于分支末端(圖2B第一張圖)，UW皮膚成纖維細胞幾乎只存在于底部分支(圖2B第二組)。他們假設下臂代表了再生修復軌跡，成纖維細胞向UW樣狀態(tài)進展，而上臂(富含PBS/缺乏UW皮膚成纖維細胞)是一個相對纖維化的軌跡。值得注意的是，在再生臂中發(fā)現(xiàn)了一些PBS創(chuàng)面成纖維細胞(圖2B第二組)，突出說明再生和纖維化可能在細胞上并不相互排斥;具有促再生活性的細胞可能存在于疤痕傷口中，但在缺乏干預(例如，YAP抑制)的情況下，促纖維化分子編程可能會覆蓋這一點，并導致主要的疤痕表型。
接下來,他們試圖識別出可再生成纖維細胞和再生成纖維細胞軌跡的明顯特征。louvainbase(Seurat)聚類識別出6個成纖維細胞集群：集群0和4組成“再生”臂；1、2、5組成“纖維性”臂；3個主要包括UW皮膚成纖維細胞(圖2B最后一個面板和3A)。研究者沿著感興趣的主要軌跡計算每個基因的擬時序皮爾森相關性(圖2B第三組)。纖維化臂(簇1、2和5)富含已知的促纖維化標志物，如Dpp4、Fap和Gpx3(圖2C和3B)。纖維細胞型軌跡細胞也表達了更多的Fgf2、Il6、Ccl2、Myc和Tead1，其在成纖維細胞中的上調(diào)且與焦粘附激酶(FAK)-介導的器官纖維化和腫瘤基質(zhì)沉積有關。GSEA分析顯示在基因的前1%與擬時序呈正相關,揭示了ECM沉積,生長因子，機械化以及與纖維相關的應激物(MAPK)/ Ras信號和焦點粘附(圖2D和3D)，支持經(jīng)典的親纖維性表型。
他們接下來研究了與擬時序強負相關的基因，并發(fā)現(xiàn)了多種發(fā)展- /再生相關的基因(圖2F和3C),包括Bmp4類似的與再生損傷反應有關的基因。他們還確定了幾個參與Wnt信號的基因，包括Wnt靶標Axin2和Twist1；Wnt通路調(diào)控因子Trps1，其與HF形態(tài)發(fā)生有關。通過對與擬時序負相關的前1%基因進行GSEA分析，再生臂的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)和Wnt相關條目富集；被富集到的條目也包括多個與Wnt相關的條目和“調(diào)節(jié)干細胞多能性的信號通路”(圖2G和3E)。接下來，他們使用SCENIC平臺比較基于基因調(diào)控網(wǎng)絡的軌跡 (圖2I)。Trps1、Gli1和Twist1調(diào)控子在再生臂中被更多激活(圖2J)，進一步支持Wnt激活。他們還做了基于CellChat方法的細胞互作分析 (圖4A和4B)。CellChat強調(diào)了增強的促炎癥信號(例如:,CXCL和IL6)在再生臂中涉及瘢痕(PBS)成纖維細胞和非標準Wnt信號(圖4C-4E)。
接下來，他們又做了RNA速率分析。結(jié)果顯示，纖維化臂和再生臂的RNA速率方向相反，纖維化臂中的載體指向增加的POD，而再生臂中的載體指向更早的時間點細胞(圖2K)。他們還應用了CytoTRACE。結(jié)果顯示，UW皮膚成纖維細胞分化程度最高(CytoTRACE評分較低)，而傷口成纖維細胞分化程度相對較低(評分較高;圖2 L)。纖維臂成纖維細胞總體上分化較少，隨著POD的增加分化增加(分數(shù)降低)，而再生臂細胞沿軌跡分化減少，表明隨著愈合的進展，發(fā)育潛力增加。接下來，他們分別分析了組成每個軌跡的聚類，并檢測了與每個分支的CytoTRACE評分最相關的基因。在纖維力臂中，隨著時間的推移，分數(shù)的減少很大程度上是由與ECM相關的基因(圖3F上)驅(qū)動的,與成熟的瘢痕成纖維細胞的命運相一致。另一方面，在再生臂中隨著時間的推移，在再生臂上的分數(shù)增加(圖3F下)，與HF和ECM再生一致，在治療后最突出(POD 14/30，圖1)�？偟膩碚f，CytoTRACE在RNA速度分析上支持相反的細胞軌跡，并獨立支持纖維化與再生臂表型。
3、多模態(tài)數(shù)據(jù)集成分析傷口修復軌跡
為了跨平臺分析，他們首先嘗試將成纖維細胞(Lin−)蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)與scRNA-seq數(shù)據(jù)廣泛關聯(lián)起來。纖維臂中富集的蛋白質(zhì)的GSEA顯示了與生長因子信號、機械信號、收縮性和ECM沉積/組織和ECM成分(膠原、腓纖維蛋白[Fbln1]和纖維連接蛋白[Fn1]；圖2 E) 強相關的條目富集。相比之下，再生臂缺乏機械信號、收縮力或ECM相關條目，與scRNA-seq一致(圖2H)。接下來，他們將scRNA-seq數(shù)據(jù)與ECM結(jié)構(gòu)和HF/gland計數(shù)的變化相關聯(lián)結(jié)果顯示，簇5細胞高表達Dpp4、Il6和Ccl2，是瘢痕成纖維細胞的特征(圖3B)。
研究者在進行多模式分析之后確定了Trps1在再生中的功能意義，但具體如何確定的呢？請見下回詳解……
