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文章詳情

文章題目：Midkine expression by stem-like tumor cells drives persistence to mTOR inhibition and an immune-suppressive microenvironment

中文題目：干細胞樣腫瘤細胞的Midkine表達驅(qū)動mTOR抑制和免疫抑制微環(huán)境的持續(xù)

見刊時間：2022.08

期刊名稱：nature communications

影響因子：17.694

實驗平臺：10x Genomics scRNA-seq、10x Visium spatial transcriptomics profiling

DOI：10.1038/s41467-022-32673-7

 

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圖解摘要

我們之前詳細介紹了研究者對AML 和 LAM的單細胞分析、AML細胞中的通路和遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的圖譜以及AML腫瘤細胞表現(xiàn)為兩種主要狀態(tài):干細胞樣和炎性，現(xiàn)對接下來中間部分的內(nèi)容進行詳細介紹。

 

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研究內(nèi)容

AML細胞的干細胞樣細胞群可能與雷帕霉素耐藥有關(guān)

研究者觀察到腫瘤細胞亞群的干性和休眠性增強，這是耐藥性腫瘤細胞的典型特征，這促使研究者直接研究雷帕霉素在AML細胞中的耐藥性。他們從本研究分析的AML腫瘤之一做了原代培養(yǎng)，并用DMSO（對照）或雷帕霉素（實驗）處理這些細胞，然后進行scRNA-Seq分析（圖3a），聚類確定了7個細胞群（圖3b），AML細胞占33%（圖3c）。集群4包含來自對照組和雷帕霉素治療組的AML細胞，表明它包含對雷帕霉素有抵抗力的細胞，或者至少是轉(zhuǎn)錄沒有被雷帕霉素治療改變的細胞。在這個集群中，許多AML腫瘤標志基因的表達不受雷帕霉素的影響，而在其他集群中雷帕霉素抑制了這些腫瘤基因的表達，例如CTSK（圖3d）。此外，第4群中的細胞顯示出高干性評分（圖3e）和高休眠評分（圖3f和補充圖6c）。NR2F1調(diào)節(jié)子的活性在這個簇中也很高（圖3g）。

據(jù)報道，MDK在其他腫瘤中介導(dǎo)耐藥性，為了確定MDK是否參與雷帕霉素耐受，以及MDK是否受TSC途徑的調(diào)節(jié)，研究者使用了兩種TSC的細胞模型，發(fā)現(xiàn)與TSC2-reexpressing 621-103細胞相比，在TSC2缺陷的AML患者衍生的621-101細胞中，以及與TSC2-add back TTJ+ TSC2細胞相比，MDK的表達上調(diào)了（圖3h）。與對照組相比，患者來源和小鼠來源的TSC2缺陷細胞系中的MDK水平都明顯升高（圖3i）。接下來，研究者用DMSO、雷帕霉素（20 nM）、iMDK（MDK抑制劑，1 µM）或雷帕霉素（20 nM）和iMDK（1 µM）的組合處理TSC2缺陷細胞（621-101，TTJ）和正常人類成纖維細胞（NHLF）。在所有3個細胞系中，單獨使用iMDK處理的效果最小。當(dāng)與雷帕霉素結(jié)合時，iMDK對兩個TSC2缺失的細胞系有協(xié)同作用（圖3j）。他們將協(xié)同作用定義為兩種藥物的綜合效果大于每種藥物的單獨活性之和。為了確定iMDK是否在體內(nèi)使腫瘤對雷帕霉素治療敏感，他們使用TSC2缺陷的TTJ細胞在免疫缺陷的無胸肌裸鼠體內(nèi)產(chǎn)生皮下腫瘤。與單獨使用雷帕霉素相比，iMDK和雷帕霉素的聯(lián)合治療導(dǎo)致了更快的腫瘤反應(yīng)的發(fā)生，以及更低的腫瘤負擔(dān)，而單獨使用iMDK沒有明顯的效果（圖3k，補充圖6d）。

圖3. AML細胞的干細胞群可能有助于雷帕霉素的抗性a

 

異質(zhì)性腫瘤細胞狀態(tài)對內(nèi)皮細胞的重塑

研究者探究了SLS和IS對腫瘤微環(huán)境的潛在不同影響。在6個AML樣本中，2個AML主要由IS組成（>70%），4個主要是SLS（>80%）（圖4a）。以SLS為主的腫瘤有更多的內(nèi)皮細胞（圖4b）。為了驗證這一點，他們對每個AML進行了內(nèi)皮細胞標記物CD31的免疫組化（IHC）染色，發(fā)現(xiàn)與scRNA-Seq預(yù)測的百分比有很強的相關(guān)性（圖4c），在SLS主導(dǎo)的腫瘤中內(nèi)皮細胞的百分比更高（圖4d，補充圖7a）。差異表達分析顯示，MDK的表達要比VEGFD高得多，MDK在群集1（SLS）中表達較高，而VEGFD在群集3（IS）中表達較高 (圖4e)。這些數(shù)據(jù)表明，SLS腫瘤中促血管生成的MDK的高表達可能是該亞型AML中富含內(nèi)皮細胞的原因。

圖4. 以SLS為主的腫瘤的內(nèi)皮細胞重塑

 

scRNA-Seq和scTCR-Seq的綜合分析揭示了SLS優(yōu)勢腫瘤的T細胞功能障礙和抑制的克隆擴展

在人類TSC腫瘤中已經(jīng)觀察到T細胞的浸潤和衰竭，并且在小鼠模型中觀察到免疫療法的明顯益處。為了確定T細胞是否受到AML中腫瘤細胞狀態(tài)的影響，研究者重點研究了4個與正常腎臟配對的AML，其中2個以SLS為主，2個以IS為主。對腫瘤來源的CD8+T細胞進行重新聚類，發(fā)現(xiàn)了3個主要的細胞群：記憶/免疫T細胞（CD8 Tm/naive）、效應(yīng)T細胞（CD8 Teff）和增殖T細胞（CD8 T-prolif），以及每個主要細胞群中的亞群，它們具有不同的免疫檢查點基因或細胞毒性效應(yīng)基因的表達（圖5a，b）。來自SLS優(yōu)勢腫瘤的CD8+T細胞與來自IS優(yōu)勢腫瘤的CD8+T細胞相比，顯示出更低的細胞毒性分數(shù)，而且每個亞群內(nèi)的細胞毒性細胞（定義為表達至少一種細胞毒性效應(yīng)基因）的百分比也較低（圖5c）。此外，SLS主導(dǎo)的腫瘤衍生細胞表現(xiàn)出更高的衰竭分數(shù)（圖5c）。盡管每個亞群中衰竭細胞的頻率大致相同（圖5c），但SLS主導(dǎo)的腫瘤中衰竭的CD8+Teff細胞的比例高于IS主導(dǎo)的腫瘤，而IS主導(dǎo)的腫瘤顯示出更高的細胞毒性CD8+Teff和CD8+Tm/Naive群體的頻率（圖5d）。對腫瘤來源的CD4+T細胞的類似分析顯示了6種CD4+T細胞的亞型（圖5e，f）。雖然來自IS顯性腫瘤的記憶型CD4+T細胞和CD40LG高的群體顯示出較高的細胞毒性分數(shù)（圖5g），但在SLS顯性腫瘤和IS顯性腫瘤之間沒有觀察到任何亞型的細胞頻率的明顯差異（圖5h）。

腫瘤激活的淋巴細胞會發(fā)生克隆性擴增，來自同一克隆的擴增T細胞具有相同的TCR序列（克隆型）。研究者發(fā)現(xiàn)在以IS為主的腫瘤中，有229個克隆型在CD8+T細胞亞型中共享，319個克隆型在CD4+T細胞亞型中共享，但在以SLS為主的腫瘤中只有5個克隆型在CD8+T亞型中共享（圖5i）。SLS腫瘤在CD8+T群體中顯示出相當(dāng)有限的亞型之間的克隆型共享，而在CD4+T群體中沒有克隆型共享，而IS腫瘤在CD8+T和CD4+T群體中都顯示出亞型之間廣泛的克隆型共享（圖5j）。CD8+ Teff亞型中75%的擴增TCRs與IS腫瘤中的CD8+ Tm/Naive亞型共享，顯示了這兩種CD8+ T細胞狀態(tài)之間的動態(tài)聯(lián)系。在IS腫瘤中，大多數(shù)增殖的CD8+T細胞與CD8+Teff群體共享克隆型，這可能意味著腫瘤抗原反應(yīng)性T細胞增殖（圖5j）。增殖的T細胞與兩個細胞毒性Taff群體（CD8 Teff-TNF和CD8 Teff-IFNG）共享大量的克隆型。此外，在CD8 Teff和兩個細胞毒性Teff群體（CD8 Teff-TNF和CD8 Teff-IFNG）之間觀察到廣泛的克隆共享，這表明向功能性T細胞分化的軌跡是活躍和動態(tài)的。這些觀察結(jié)果表明，在IS腫瘤中觀察到的高頻率的細胞毒性CD8+T細胞，至少部分是由于可能的腫瘤識別效應(yīng)細胞的動態(tài)分化。研究者使用RNA速率分析支持了從CD8效應(yīng)T細胞到增殖T細胞以及從多個CD4+T亞群到Tregs的分化軌跡（圖5k）。相反，以SLS為主的腫瘤顯示出亞型之間有限的分化潛力。

圖5. 在SLS主導(dǎo)的腫瘤中，T細胞功能紊亂和T細胞克隆擴展受到抑制