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摘要

mTORC1在多種癌癥類型中異�；钴S。此研究對結節(jié)性硬化綜合癥(TSC)與mTORC1極度活躍相關的腫瘤進行了單細胞轉錄組分析、配對T細胞受體(TCR)測序和空間轉錄組分析，并通過腫瘤調節(jié)的免疫抑制性巨噬細胞確定了一種與T細胞功能障礙有關的干細胞樣腫瘤細胞狀態(tài)（SLS）。雷帕霉素及其衍生物(rapalogs)是治療TSC腫瘤的主要藥物，干細胞樣腫瘤細胞在體外表現(xiàn)出雷帕霉素耐藥，這讓研究者聯(lián)想到這些藥物對患者細胞的抑制作用。促血管生成因子midkine (MDK)在SLS群體中高度表達，并在SLS優(yōu)勢樣本中與內皮細胞的富集相關。MDK抑制與雷帕霉素在體內外協(xié)同抑制TSC細胞系的生長。綜上所述，本研究提示mTORC1高活性的干細胞樣狀態(tài)腫瘤細胞通過免疫抑制，存在一種自分泌雷帕霉素耐藥機制和旁分泌腫瘤生存機制。

 

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文章詳情

文章題目：Midkine expression by stem-like tumor cells drives persistence to mTOR inhibition and an immune-suppressive microenvironment

中文題目：干細胞樣腫瘤細胞的Midkine表達驅動mTOR抑制和免疫抑制微環(huán)境的持續(xù)

見刊時間：2022.08

期刊名稱：nature communications

影響因子：17.694

實驗平臺：10 x Genomics scRNA-seq、10 x Visium spatial transcriptomics profiling

DOI：10.1038/s41467-022-32673-7

 

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研究內容

AML 和 LAM的單細胞分析

研究者對腫瘤切除時獲得的6個腎性AML腫瘤和4個正常組織進行scRNA-Seq和scTCR-Seq（圖1a）。在肺移植時獲得的5個LAM組織也進行了scRNA-Seq。過濾掉低質量的細胞后，共分析了來自AML的108,071個細胞和來自匹配的正常腎臟的33,136個細胞；分析了LAM肺部樣本的42,202個細胞。AML組織和正常組織的免疫和基質區(qū)的主要細胞類型見圖1b, c。正常腎臟含有49%的上皮細胞，而AML中只有1.1%的上皮細胞（圖1d）。與正常組織相比，許多免疫類細胞在腫瘤組織中被富集，包括巨噬細胞（18.3% vs 2.7%）、樹突狀細胞（4% vs 0.7%）和T細胞（32.6% vs 14.1%）。在LAM組織中發(fā)現(xiàn)的主要細胞類型包括免疫細胞（T細胞、NK細胞、B細胞、巨噬細胞和單核細胞）、間質細胞、上皮細胞和內皮細胞（淋巴細胞和血液）（圖1e）。

 

AML細胞中的通路和遺傳調控網絡的圖譜

對間質細胞群的重新聚類顯示了來自正常腎組織和AML腫瘤組織的獨立細胞群（圖1f）。除了AML細胞（如上所述），該集群還包含腫瘤相關的成纖維細胞（TAF）。通過Seurat的差異基因表達分析發(fā)現(xiàn)，與TAF和正常腎臟相比，160個基因在腫瘤細胞中唯一上調，包括以前報道的基因（如GPNMB、SQSTM1/p62、MMP2、PTGDS）和參與腫瘤轉移的基因（如MMP11、MDK、DCN、PDPN）（圖1g，補充圖3b，補充數(shù)據1）。與匹配的正常間質細胞相比，兩個長的非編碼RNAs（lncRNAs）（MALAT1，NEAT1）在腫瘤細胞和腫瘤相關的成纖維細胞中都被上調（圖1g和補充圖3c），表明AML細胞重塑了成纖維細胞。為了確定AML細胞與TAF和正常腎臟的不同調節(jié)途徑，研究者使用了基因集變異分析（GSVA）。標志性的基因集分析（包含50個基因集）確定了參與膽固醇平衡的基因是AML細胞中上調最多的途徑，而第二大上調途徑是mTORC1信號傳導，這是在AMLs和LAM中TSC2損失的一個眾所周知的生化效應（圖1h）。研究者使用SCENIC分析發(fā)現(xiàn)：在AML細胞中更多的調控因子被上調。該分析還確定了與AML相關的轉錄因子和調節(jié)子，包括參與表觀遺傳調控的幾個因子，如HDAC2、SIRT6、FOXN3、MEF2A（圖1i，補充圖3d。補充資料2、3）。所關注的具體基因包括MDK（在此新發(fā)現(xiàn)的在AML中高表達的基因）和GPNMB（AML的一個已知標記）。研究者使用RNA原位雜交，在AML腫瘤中檢測到MDK的表達，但在鄰近的正常腎臟中沒有檢測到（圖1j）。MDK是一種肝素結合的生長因子，能促進細胞生長和血管生成。

圖1. 血管肌瘤（AML）和淋巴管瘤病（LAM）的單細胞圖譜

 

AML腫瘤細胞表現(xiàn)為兩種主要狀態(tài):干細胞樣和炎性

對6596個AML細胞進行重新聚類顯示了四個細胞群（圖2a，b）。Custer 1顯示中胚層特異性轉錄因子21（TCF21）的相對高表達，這是平滑肌細胞表型調節(jié)的主調控因子（圖2b，補充圖4b）。他們注意到幾個基因（SOX4，TCF4）（圖2b，補充圖4c），已知是干細胞標志物。研究者計算 "干性評分"并發(fā)現(xiàn)：群組1顯示出最高的干性分數(shù)（圖2c），并顯示出炎癥基因的高表達（圖2b，補充圖4e）�；�于這些特征，他們將聚類1定義為干細胞樣狀態(tài)（SLS），聚類2定義為炎癥狀態(tài)（IS）。嘌呤相關的代謝與mTORC1途徑有關，高水平的嘌呤核苷酸是維持癌癥干性所必需的，而外部補充次黃嘌呤則會促進腫瘤干性。研究者從單細胞轉錄組中產生了偽Bulk RNA-seq數(shù)據，并發(fā)現(xiàn)與正常對照組相比，兩種腫瘤細胞狀態(tài)下嘌呤途徑中鳥嘌呤/鳥苷的代謝都升高了（圖2d）。

人們越來越認識到，缺氧的微環(huán)境以及轉移過程中誘發(fā)的壓力會引發(fā)休眠狀態(tài)，使腫瘤細胞對藥物治療和壓力產生抗性。研究者進一步分析一組休眠標記基因，發(fā)現(xiàn)在SLS群體中高表達（群集1），包括轉錄因子NR2F1（圖2e）。NR2F1通過整合靜止和生存的表觀遺傳程序，成為誘導和維持腫瘤干細胞休眠的一個關鍵節(jié)點。Regulon分析證實，NR2F1 regulon活性在SLS（群集1）中被上調（圖2f）。并且雌二醇處理增加了NR2F1的表達和regulon活性（圖2g）。研究者通過對SLS和IS的marker（MDK和TAGLN，圖2i）以及Cathepsin K（AML/LAMmarker基因）進行共染色，在腫瘤樣本中鑒定到了SLS和IS群體。量化顯示MDK和TAGLN幾乎沒有共定位，而MDK與CTSK或TAGLN與CTSK廣泛共染（圖2j），支持存在兩個不同的AML細胞群，MDK+和TAGLN+。

 

LAM中出現(xiàn)的細胞群與AML中觀察到的兩種類型相似

遺傳學研究顯示，AML和LAM的細胞來自一個共同的前體細胞。為了確定在AML中發(fā)現(xiàn)的兩種細胞狀態(tài)是否存在于肺部LAM中，研究者使用與AML相同的標記基因組和方法分析了五個LAM肺部的57186個細胞，共鑒定了375個LAM細胞（圖1e）并聚類成了4個細胞群（圖2k）。與AML相似，一個集群表達SLS/調節(jié)性平滑肌標志基因（集群2），另一個集群表達IS/收縮性平滑肌標志基因（集群1）（圖2l）。還確定了一個表達所有這些基因的中間狀態(tài)（簇0）。SLS群體和中間狀態(tài)顯示出較高的干性評分（圖2m）。此外，與SLS AML細胞一樣，LAM細胞的SLS群也有NF2F1表達和調節(jié)子活性的上調（圖2n）。在LAM細胞中，VEGFD（一種有效的LAM生物標志物）的表達遠遠低于MDK（一種有效的血管生成和淋巴管生成的生長因子）（圖2o），表明MDK在LAM相關的淋巴管生成中的潛在作用。

圖2. AML和LAM細胞狀態(tài)的異質性

 

未完待續(xù)

那么AML細胞的干細胞樣細胞群與雷帕霉素耐藥相關性、異質性腫瘤細胞狀態(tài)對內皮細胞的重塑以及scRNA-Seq和scTCR-Seq的綜合分析如何揭示了SLS優(yōu)勢腫瘤的T細胞功能障礙和抑制的克隆擴展請見下回詳解。