概述
本文描述的反相蛋白質(zhì)微陣列 (RPPA) 平臺(tái)位于巴黎（法國(guó)）居里研究所內(nèi)。 該RPPA 平臺(tái)的總體目標(biāo)是通過(guò)信號(hào)通路分析提供關(guān)于蛋白表達(dá)水平及其活性的生物學(xué)新見(jiàn)解，最終目標(biāo)是改善癌癥患者的治療和療效。該平臺(tái)使用高通量自動(dòng)化設(shè)備（包括 InnoScan 710-IR 掃描儀）對(duì)各種類型的微量樣品進(jìn)行個(gè)性化蛋白質(zhì)組學(xué)分析。 將介紹 RPPA 技術(shù)的基礎(chǔ)知識(shí)，并指出 InnoScan 710-IR 的日常使用如何成為該平臺(tái)工作流程的重要組成部分。最后將描述居里研究所進(jìn)行的癌癥研究應(yīng)用案例，以說(shuō)明 InnoScan 710-IR 的易用性和可靠性。
 
正文
反相蛋白微陣列 (RPPA) 是一種高通量小型化斑點(diǎn)印跡和基于抗體的技術(shù)（圖 1A），可以分析蛋白表達(dá)水平和信號(hào)通路的激活狀態(tài)（通過(guò)研究磷酸化或總蛋白表達(dá)）。它結(jié)合了高通量分析和消耗微量樣品的優(yōu)點(diǎn)。事實(shí)上，由于 RPPA 技術(shù)是一種多指標(biāo)檢測(cè)技術(shù)，因此可以在同一張覆有硝酸纖維素的載玻片芯片（微陣列）上同時(shí)分析多達(dá)一千個(gè)樣本。RPPA 工作流程在圖 1，B 中進(jìn)行了描述。使用專用芯片點(diǎn)樣儀，每個(gè)樣品和每個(gè)點(diǎn)僅打印 1 至 2 ng 的細(xì)胞或組織裂解液。點(diǎn)樣的樣本可以是腫瘤樣本、異種移植物、細(xì)胞系或這些樣本的組合，并以連續(xù)稀釋和復(fù)制的方式系統(tǒng)性地點(diǎn)樣，使該技術(shù)具有高穩(wěn)定性和數(shù)據(jù)可定量。然后，使用自動(dòng)染色機(jī)，將微陣列按序與抗體和熒光染料孵育以檢測(cè)感興趣的蛋白（圖 1A）：

在居里研究所，RPPA 平臺(tái)測(cè)試了 2000 多種商業(yè)抗體，并驗(yàn)證了 640 種用于 RPPA 標(biāo)記的一抗，其中近 150 種抗磷酸化蛋白。這組抗體涵蓋了大多數(shù)細(xì)胞信號(hào)通路。對(duì)于每個(gè)項(xiàng)目，研究員從經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的抗體中選擇感興趣的抗體。 RPPA 平臺(tái)不斷評(píng)估新抗體，并驗(yàn)證特定抗體以滿足合作者的要求。陽(yáng)性和陰性對(duì)照使用標(biāo)有總蛋白染色 FCF（來(lái)自 Grace Biolabs 的方案）標(biāo)記的微陣列作為陽(yáng)性對(duì)照，未標(biāo)記一抗的微陣列作為陰性對(duì)照。在量化和數(shù)據(jù)分析之前（圖 1C），用InnoScan 710-IR檢測(cè)每個(gè)樣品點(diǎn)的紅外熒光。掃描儀有兩個(gè)激發(fā)激光：785nm 和 670nm。得益于實(shí)時(shí)自動(dòng)對(duì)焦和自動(dòng)進(jìn)樣器，可以連續(xù)自動(dòng)掃描 24 張芯片。10µm/像素掃描精度，在 4 分鐘時(shí)間內(nèi)完成一張載玻片芯片的掃描。載玻片上的硝酸纖維素在紅色光譜中具有自發(fā)熒光。研究人員選擇使用近紅外熒光來(lái)降低硝酸纖維素的背景熒光，提高信噪比。 InnoScan 710-IR 規(guī)格完全符合需提供可靠數(shù)據(jù)的要求，其靈敏度與比色檢測(cè)相似，但線性范圍更寬。
 
圖 1：反相蛋白質(zhì)微陣列工作流程說(shuō)明。 A. RPPA 的原理，小型化高通量斑點(diǎn)印跡。在使用熒光標(biāo)記抗體檢測(cè)蛋白質(zhì)之前，將蛋白質(zhì)打印到硝酸纖維素膜載玻片上。 B. 從蛋白質(zhì)提取到通過(guò) InnoScan 710-IR采集圖像的工作流程。 C. 使用 PARYS 軟件對(duì)圖像進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
 
 
癌癥研究的應(yīng)用：
 
該RPPA 平臺(tái)參與了多種項(xiàng)目，涵蓋臨床試驗(yàn)評(píng)估相關(guān)基本問(wèn)題，對(duì)合作者提供的樣本提供個(gè)性化的高通量蛋白質(zhì)組學(xué)分析，允許：

• 蛋白表達(dá)水平分析
• 細(xì)胞信號(hào)通路激活狀態(tài)及動(dòng)態(tài)分析
• 預(yù)后或預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物的鑒定
• 鑒定潛在治療靶點(diǎn)
• 基于蛋白質(zhì)譜的樣品分類
• 藥效學(xué)研究

 
宮頸癌 (CC)：RAIDs 聯(lián)盟歐洲項(xiàng)目
宮頸癌 (CC) 仍然是女性中第二大最常見(jiàn)的癌癥。大多數(shù)宮頸癌是由高危型人乳頭瘤病毒 (HPV) 的持續(xù)感染引起的。事實(shí)上，它們通過(guò)病毒蛋白 E6 和 E7 使正常細(xì)胞控制失效，導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定、分子改變的積累、抑癌基因失活和癌基因激活。 RAIDs 歐盟 (EU) 資助的研究在 2013 年至 2017 年間收集了前瞻性宮頸癌樣本（腫瘤和血液）和臨床數(shù)據(jù)集，涉及來(lái)自七個(gè)歐盟國(guó)家 18 個(gè)中心的 419 名參與患者。到目前為止，已經(jīng)進(jìn)行了下一代測(cè)序（NGS），能夠解析顯性遺傳改變，并且應(yīng)用反相蛋白質(zhì)微陣列（RPPA）研究細(xì)胞信號(hào)通路。
居里研究所RPPA 平臺(tái)處理了 280 個(gè)樣本，包括基線和非基線腫瘤和細(xì)胞系。如前所述（Scholl S, et al., EBioMedicine 2019, PMID: 30952619）進(jìn)行樣品處理（蛋白質(zhì)提取、定量、連續(xù)稀釋、陣列點(diǎn)印、標(biāo)記、掃描、定量和分析）。
采用 194 種特異性一抗對(duì)蛋白質(zhì)反向微陣列進(jìn)行檢測(cè)。使用 InnoScan 710-IR (INNOPSYS) 掃描了355張載玻片微陣列 ，785 nm波段用于檢測(cè)抗體或陰性對(duì)照，670nm波段用于檢測(cè)陽(yáng)性對(duì)照。

RPPA 蛋白表達(dá)數(shù)據(jù)的無(wú)監(jiān)督聚類揭示了三個(gè)患者群，分別為富含 EMT（上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化）、DNA 損傷信號(hào)和 MAPK（Map激酶）/ PI3K（PI3 激酶）通路，見(jiàn)圖 2。與其他兩個(gè)集群組合相比，“EMT”集群中的患者顯示出更短的無(wú)進(jìn)展生存期 (PFS), 見(jiàn)圖 3（p=0.03）。
 

圖 2：在基線腫瘤中，鑒定了具有不同蛋白質(zhì)表達(dá)譜的三個(gè)主要簇。表征每個(gè)簇的蛋白質(zhì)：簇 1富含EMT、ErbB 信號(hào)，簇 2富含DNA 損傷信號(hào)，簇 3富含p38 MAPK 和 PI3K 信號(hào)。
 

圖 3：由 RPPA 分析定義的宮頸癌患者亞組無(wú)進(jìn)展生存期（n=136）。 “EMT”簇（紅色）與 DNA 損傷和 MAPK/PI3K 信號(hào)（藍(lán)色）蛋白表達(dá)簇的結(jié)果比較表明，腫瘤顯示 EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)的患者無(wú)進(jìn)展生存期較差。
 
 
此外，來(lái)自簇 1 樣本的特征不僅在于 EMT，還在于 PD-L1（程序性死亡配體 1 或 B7-H1）和 B7-H4（或 VTCN1，對(duì)于含有 V 組結(jié)構(gòu)域的 T 細(xì)胞激活抑制劑 1）的上調(diào)表達(dá)。見(jiàn)圖 4。
PD-L1 屬于 B7 蛋白家族。它是一種在抗原呈遞細(xì)胞（和一些癌細(xì)胞）表面表達(dá)的蛋白質(zhì)，與在T 細(xì)胞上的PD1 受體結(jié)合，當(dāng)它與其受體連接時(shí)，通過(guò)抑制 T 細(xì)胞活化來(lái)調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)。
B7-H4 也屬于 B7 蛋白家族，抑制 T 細(xì)胞活化、增殖、細(xì)胞因子產(chǎn)生和細(xì)胞毒性形成，負(fù)向調(diào)節(jié) T 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。這就是為什么，在未來(lái)EMT 生物標(biāo)志物有可能鑒定出能受益于免疫檢查點(diǎn)抑制劑 (ICI) 療法的患者。最后，基于 RPPA 技術(shù)，在三個(gè)簇中觀察到 DNA 修復(fù)蛋白的表達(dá)和激活差異。這一結(jié)果可能會(huì)引起臨床對(duì) PARP 抑制劑治療的興趣。
 
  圖 4： RPPA 技術(shù)揭示的 PD-L1 和 B7-H4 的相對(duì)表達(dá)水平。 PD-L1 的高表達(dá)水平和 簇1 - EMT 的低表達(dá)水平。
 
 
肝細(xì)胞癌 (HCC) 項(xiàng)目
肝細(xì)胞癌 (HCC) 是異質(zhì)性和侵襲性腫瘤。由于這種腫瘤分子機(jī)制的復(fù)雜性，目前的治療方案在晚期階段不是很有效，在生存方面的益處有限。
該項(xiàng)旨在發(fā)現(xiàn)可能對(duì)肝細(xì)胞癌有效的新化合物或分子和發(fā)現(xiàn)治療反應(yīng)生物標(biāo)志物。該平臺(tái)研究人員使用 RPPA（Caruso S 等人， Gastroenterology 2019，PMID：31063779）研究了 400 個(gè)樣本（包括 360 個(gè)人類肝腫瘤和非腫瘤組織以及 40 個(gè)肝癌衍生細(xì)胞系 (LCCL)）的生物活性。并分析了涉及各種信號(hào)通路的 126 種蛋白質(zhì)； 82 種總蛋白和 44 種磷酸化蛋白，總共 215 張載玻片微陣列。在 LCCL 數(shù)據(jù)中，RPPA 結(jié)果的無(wú)監(jiān)督聚類將 LCCL 分為 3 個(gè)亞組，這些亞組反映了轉(zhuǎn)錄組亞群和細(xì)胞分化狀態(tài)（見(jiàn)圖 5）。
圖 5：LCCL 蛋白質(zhì)圖譜的分層聚類以及與轉(zhuǎn)錄組亞群的關(guān)聯(lián)（c2 檢驗(yàn)）。第 1 簇：祖細(xì)胞亞類，第 2 組：混合上皮間充質(zhì)，第 3 組：間充質(zhì)樣細(xì)胞
 
 
在簇 1（祖細(xì)胞亞類）中，肝特異性基因和胎/祖細(xì)胞標(biāo)記物（ALDH1A1、E-鈣粘蛋白、p190A、RSK2、Her3、FGFR4、細(xì)胞角蛋白 19）表達(dá)良好，而它們?cè)诖?3（間充質(zhì)樣細(xì)胞）中下調(diào).
 簇 2（混合上皮、間充質(zhì)）和簇 3 有高表達(dá)水平的 TGF-β，沒(méi)有典型的 β-連環(huán)蛋白和 EMT 蛋白，這表明這些細(xì)胞的 WNT 和 TGF-β 通路被激活，見(jiàn)圖 6 。

 

圖 6：RPPA方法LCCL 蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)水平。 LCCL 轉(zhuǎn)錄組亞組之間差異表達(dá)的 19 種蛋白質(zhì)的箱線圖（Mann-Whitney 檢驗(yàn)）。
 
 
細(xì)胞系和腫瘤的 RPPA 數(shù)據(jù)結(jié)合基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)表明，肝癌細(xì)胞系的蛋白質(zhì)譜似乎代表了來(lái)自患者的最具侵襲性肝細(xì)胞癌，是了解肝癌發(fā)展和藥物反應(yīng)的好工具。摘要如圖 7 所示。
 
圖 7：肝細(xì)胞癌分子分型。先前建立的肝細(xì)胞癌分子分型及其相應(yīng)的肝癌衍生細(xì)胞系亞組與本研究中發(fā)現(xiàn)的主要藥物與生物標(biāo)志物的關(guān)聯(lián)總結(jié)。從以前研究總結(jié)的肝細(xì)胞癌分子分型和相關(guān)特征。 Ampl，放大； mut，突變。
 
結(jié)論:
反相蛋白質(zhì)微陣列是一種基于抗體的微型高通量技術(shù)，可以從少量生物樣品中檢測(cè)數(shù)百種蛋白質(zhì)和磷酸化蛋白質(zhì)。 RPPA 的靈敏度與 InnoScan 710-IR掃描儀相結(jié)合是完美的組合，可以為您的研究項(xiàng)目提供將磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)方法與其他組學(xué)方法相結(jié)合的機(jī)會(huì)。這一強(qiáng)大的研究工具可幫助您研究信號(hào)通路，了解藥物的作用機(jī)制，并為預(yù)后或治療目標(biāo)尋找新的生物標(biāo)志物。
 
 
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