固相多肽合成主要指的是將受保護的氨基酸衍生物連續(xù)添加到生長的肽鏈中，包括脫保護和洗滌步驟，以除去未反應(yīng)的基團和副產(chǎn)物。如果每一步都是100%完成，那就會形成一個全長的肽，但是這種情況很難發(fā)生，因為無論合成方案如何優(yōu)化，總是會存在副反應(yīng)或者反應(yīng)不完全的情況，從而影響肽的純度。因此，提高肽純度是固相多肽合成應(yīng)用中的關(guān)鍵點。

01/如何測定肽純度

肽純度的測量通常使用反向高效液相色譜法（RP-HPLC）和質(zhì)譜法（MS），另外，氨基酸分析也可用于計算肽的產(chǎn)量或?qū)嶋H量。

02/不同標準下肽純度的應(yīng)用

固相多肽合成過程中最常見的雜質(zhì)主要包括以下幾類：刪除序列、截斷序列、不完全脫保護序列、裂解過程中修飾的序列（肽上其他位置的保護基重新附著）、合成過程中形成的其他副反應(yīng)產(chǎn)物（例如天冬氨酸亞胺形成、氧化產(chǎn)物等）、TFA（三氟乙酸）和乙酸等。

根據(jù)水平的不同，這些雜質(zhì)中的一種或者多種會對您的應(yīng)用產(chǎn)生直接影響。例如，特定的階段序列可以干擾研究中的靶向結(jié)合，或者TFA可以殺死生物測定中使用的細胞。那么，首先必須對合成本身進行優(yōu)化，以確保正確的分子種類被合成達到足夠高的水平，使合成錯誤的、有問題的序列降低到非常低的水平。第二要優(yōu)化下游的處理步驟，包括合成后鹽交換的步驟，通常需要對乙酸鹽進行藥物的物質(zhì)和分析測試。第三還要檢查冷凍干燥的相對優(yōu)勢以及與將肽保持在溶液中的穩(wěn)定性測試等。

2.1 合成不同純度肽的應(yīng)用指南

2.1.1 低純度（>50%）：該水平適用于先導(dǎo)化合物的高通量篩選。如果您正在研究免疫應(yīng)答，除去特定的污染物，>70%可以用于抗原制備。

2.1.2 中等純度（>70%）：該水平足以生產(chǎn)、純化和測試免疫測定中使用的抗體、進行酶底物研究、表位作圖、親和純化、生物測定或其他免疫學(xué)應(yīng)用以及肽篩選。生物化學(xué)和半定量應(yīng)用可能需要達到>85%的純度。例如酶學(xué)、表位作圖或研究生物活性、酶-底物相互作用、磷酸化作用和蛋白質(zhì)印記或細胞黏附中的肽封閉等。

2.1.3 高濃度（>90%）：該水平適用于定量生物測定、定量體外受體-配體相互作用研究、配體結(jié)合的生物活性研究、定量阻斷和競爭性抑制試驗、定量磷酸化和蛋白水解研究、電泳標記和色譜標準分析。

2.1.4 極高純度（>98%）：該純度適用于肽作為藥物進行體內(nèi)研究、臨床試驗、藥物測試以及結(jié)構(gòu)活性關(guān)系研究。

03/優(yōu)化合成以達到所需濃度

 

實現(xiàn)特定應(yīng)用所需的純度意味著要最大限度地提高正確偶聯(lián)的效率，并最大限度地減少副反應(yīng)、缺失、外消旋化等。難度可能因肽序列不同而異。長肽（>30個氨基酸）和復(fù)合肽在合成時本身就存在很大挑戰(zhàn)，一些特定區(qū)域（例如環(huán)狀或支鏈殘基）可能在合成過程中導(dǎo)致聚集，包括疏水性氨基酸或修飾。

3.1 合成前的關(guān)鍵優(yōu)化步驟

3.1.1 序列分析：例如使用軟件在合成之前進行合成預(yù)測，以確定在整個合成過程中是否存在合成難度很大的區(qū)域。

3.1.2 副反應(yīng)風(fēng)險評估：例如外消旋化。有許多策略可以降低副反應(yīng)的風(fēng)險或有助于提高單個偶聯(lián)反應(yīng)的效率，包括偽脯氨酸、二肽構(gòu)建塊、添加劑以及替代側(cè)鏈保護。

3.2 固相多肽合成（SPPS）過程中關(guān)鍵步驟

3.2.1 樹脂選擇：SPPS通常在與1%二乙烯基苯（DVB）交聯(lián)的聚苯乙烯上進行。替代品包括聚乙二醇（PEG）衍生物，樹脂的選擇會影響合成成功率和粗品的純度。連接到柱上的連接物提供生長肽和固相載體之間的可逆連接，并確定最終產(chǎn)物的性質(zhì)和可使用的化學(xué)性質(zhì)。接頭的選擇決定了最終產(chǎn)物中的C端官能團。

3.2.2 偶聯(lián)化學(xué)：選擇通常取決于合成速度，較快的合成需要比較慢的合成（DIC、HBTU）更高反應(yīng)性（=不穩(wěn)定）的偶聯(lián)試劑（HCTU、HATU和COMU）。反應(yīng)溫度會影響偶聯(lián)化學(xué)的選擇。

3.2.3 反應(yīng)溫度：提高溫度可能會加快合成并提高純度，但并不總是如此。需要注意的是，基于微波的加熱只是加熱，微波本身對合成沒有特殊影響。

3.2.4 監(jiān)控脫保護：能夠通過實時紫外監(jiān)測來監(jiān)控，例如脫保護步驟的效率對于優(yōu)化是非常重要的。

3.2.5 雙重耦合：預(yù)測軟件確定的困難耦合可以通過雙重耦合、延長耦合時間或添加更多等效物來處理。

3.2.6 空間位阻：偶聯(lián)試劑必須足夠快速，以便可以引入空間位阻氨基酸。

3.2.7 封端：這樣做是為了在偶聯(lián)反應(yīng)后永久阻斷任何未反應(yīng)的氨基，或使完整肽的N-末端乙�；�。它對于在合成困難或長肽期間最小化缺失產(chǎn)物和輔助純化過程是有很用的。

3.2.8 溶劑使用：始終使用新鮮溶劑。重復(fù)使用溶劑會降低純度。

 

04/選擇一種能夠快速合成高純度肽的多肽合成儀

影響如何優(yōu)化SPPS以獲得所需肽純度的一個主要因素是合成儀的選擇。以下是一些幫助您選擇的建議

4.1 用于篩選方法和試劑的平行反應(yīng)容器

正如我們所看到的，優(yōu)化可以涉及查看大量的變量，并行運行不同試劑組合的能力將大大加快優(yōu)化過程。

4.2 脫保護監(jiān)測

能夠在運行期間監(jiān)測脫保護步驟的效率，避免了可能導(dǎo)致不完全脫保護、缺失和副反應(yīng)的情況。

4.3 溫度控制

提高溫度可以提高某些序列的純度。能夠同時測試不同溫度對提高生產(chǎn)率能力的影響。

4.4 最小交叉污染

提供試劑或樹脂交叉污染的多通道合成將加快優(yōu)化并將再合成的風(fēng)險降至最低。

4.5 稀有單體無需單次注射

特殊化學(xué)中使用的許多單體和試劑可能昂貴或珍貴，因此一些合成劑可從任何氨基酸/單體瓶位置提供免“單次注射”添加，以確保不會浪費任何東西。

4.6 合適的軟件

如果在GxP設(shè)施中合成肽，則需要有為符合21 CFR第11部分而設(shè)計的軟件。

Gyros Protein Technologies全自動多肽合成儀，具有獨特的Peptide Predictor功能，可以模擬多肽合成的過程，并且進行評估；具有完備的安全響應(yīng)設(shè)置，保障多肽合成的準確；矩陣式專利液體傳送技術(shù)全面保障合成高效進行；并且結(jié)合Single-shot技術(shù)，可以避免試劑浪費和規(guī)避試劑交叉污染的風(fēng)險；合成完成或合成中可直接自動原位切肽；并且軟件系統(tǒng)方便快捷，可以幫助用戶設(shè)計高效、靈活、直觀的工作流程

該多肽合成儀可以定制固相多肽設(shè)計肽疫苗，開發(fā)肽類新藥，還可以通過與核酸和多糖合成折疊體、合成肽核酸、制成類肽、合成寡核苷酸等方式，作為治療劑或檢測探針等應(yīng)用于臨床，有助于包括癌癥、阿爾茲海默病等的疾病治療。

目前在售的有Chorus、Symphony X和SONATA +三種不同型號的多肽合成儀。

   PurePep Chorus                           Symphony X               PurePep SONATA+