固相多肽合成（SPPS）涉及將受保護(hù)的氨基酸衍生物連續(xù)添加到固定在固相上的生長肽鏈中，包括脫保護(hù)和洗滌步驟，以去除未反應(yīng)的基團(tuán)和副產(chǎn)物。并行和大規(guī)模合成高純度多肽的能力徹底改變了研究，也促進(jìn)了強效治療劑和疫苗的開發(fā)。接下來簡單介紹一下固相多肽合成在研究和生物制藥開發(fā)中的應(yīng)用，并且了解到利用多肽作為疫苗和治療劑的優(yōu)勢。

一 定制多肽有助于合理的疫苗設(shè)計
傳統(tǒng)疫苗在對抗疾病方面一直是強有力的盟友，但它們有幾個缺點，包括局限于為需要在昂貴的細(xì)胞培養(yǎng)中生長的生物開發(fā)疫苗，疫苗產(chǎn)量低，而且可能引起不必要的反應(yīng)增加額外不必要的抗原載量，并且存在非毒性生物轉(zhuǎn)化為毒性形式的危險。

這些缺點刺激了基于多肽的疫苗的開發(fā)，多肽疫苗具有很大優(yōu)勢，例如具有完全限定的組分，并且無生物污染、讓定制多肽成為可能，而且可以實現(xiàn)成本效益高的大規(guī)模多肽疫苗生產(chǎn)。

基于多肽的疫苗正在針對多種病原體進(jìn)行開發(fā)，包括寄生蟲引起的瘧疾、丙型肝炎病毒、流感病毒和HIV-1等。接下來，簡單舉幾個多肽疫苗研究的實例。

01 多肽疫苗在抗擊新冠肺炎疫情的尖端研發(fā)工作中扮演了重要的角色

圖 1 設(shè)計的多表位疫苗可以同時觸發(fā)體液免疫和細(xì)胞免疫
 

圖 2 設(shè)計研究流程圖
 

Tamalika Kar等人根據(jù)SARS-CoV-2的刺突糖蛋白利用生物信息學(xué)計算設(shè)計了一種多表位疫苗。候選疫苗的總體質(zhì)量在計算機和分子動力學(xué)模擬中得到了驗證，證實了所設(shè)計疫苗的穩(wěn)定性。分子對接實驗也揭示了疫苗與Toll樣受體和MHC受體的穩(wěn)定相互作用。生物信息學(xué)克隆和密碼子優(yōu)化表明了設(shè)計的疫苗在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中的高效表達(dá)。通過生物信息學(xué)免疫模擬評估了候選疫苗觸發(fā)有效免疫應(yīng)答的效率。最后，通過計算機分析表明所設(shè)計的多表位疫苗結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，可誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答，因此可作為抗SARS-CoV-2的潛在疫苗候選。

02 多肽疫苗另一條途徑涉及一種新型的“解毒劑疫苗”可以作為抗SARS-CoV-2病毒的預(yù)防劑、免疫興奮劑和治療劑

圖 4 由RaptorX模擬的肽排列在SARS-CoV-2與ACE2結(jié)合的表面（ACE2為紅色，利用PDBePISA預(yù)測的結(jié)合表面為綠色）

Andre Watson等人開發(fā)并表征了四種新型合成多肽抑制劑SARS-BLOCK™，作為結(jié)合了預(yù)防性、治療性和免疫性特點的試劑來對抗新型冠狀病毒。他們利用計算機技術(shù)設(shè)計模擬了可以有效競爭性抑制SARS-CoV-2 S1刺突蛋白受體結(jié)合域（RBD）與ACE2結(jié)合的多肽，同時顯示出與中和抗體結(jié)合的的基序。在使用固相多肽合成（SPSS）合成多肽后，通過生物層干涉法表征了它們與ACE2和中和抗體的結(jié)合。

03 多肽也被用于癌癥疫苗中，作為一種新抗原，通常存在于腫瘤細(xì)胞表面，可作為外源T細(xì)胞的靶點，導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡
 

圖 5 基于長肽的新抗原疫苗優(yōu)于短肽疫苗的可能機制
 

治療性癌癥疫苗是最有前途的免疫治療策略之一。近來，源自腫瘤細(xì)胞的非同義突變的新抗原作為一種替代方案，可以改善腫瘤特異性并且降低靶向非腫瘤毒性，合成多肽也是一種新抗原疫苗�？梢詫⒍屉难由熳兂砷L肽以克服免疫耐受并且誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的應(yīng)答。

04 HER2相關(guān)多肽被用于增強T細(xì)胞輔助反應(yīng)，以對抗HER2表達(dá)的腫瘤細(xì)胞

圖 6 B-Vaxx多肽根據(jù)HER2/帕妥株單抗和HER2/曲妥珠單抗復(fù)合物工程化模擬構(gòu)象表位
 

圖 7 B-Vaxx多肽表位
 

HER2是人類表皮生長因子受體家族的成員，也是癌癥中研究最多的致癌基因之一。當(dāng)HER2被細(xì)胞外配體激活時，它會二聚化并經(jīng)歷轉(zhuǎn)磷酸化，以介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)并且刺激增殖。HER2是乳腺癌藥物曲妥珠單抗和帕妥株單抗的靶點。B-Vaxx多肽疫苗包含曲妥珠單抗表位、結(jié)合了混雜的T細(xì)胞表位并在I期試驗中進(jìn)行了評估，該疫苗耐受性良好。進(jìn)一步的研究正在進(jìn)行中，以確定HER2衍生多肽疫苗在癌癥治療中的治療潛力。


05 阿爾茨海默病也正在通過針對兩種蛋白質(zhì)Aβ和Tau的異常聚集的多肽疫苗來解決
 

表格 1 阿爾茲海默病肽疫苗的臨床開發(fā)

 

圖 8 （A）CAD106和（B）ACI-35的多肽組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)

阿爾茲海默�。ˋD）是一種慢性、進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病。目前尚無有效的治療方法，努力的方向主要集中在靶向病理物種β-淀粉樣蛋白（Aβ）和Tau蛋白。二者在AD的標(biāo)志性病理性神經(jīng)變性中起著重要作用。用這些蛋白質(zhì)的表位進(jìn)行免疫可能導(dǎo)致預(yù)防性清除這些蛋白的神經(jīng)毒性形式或完全避免聚集體的形成。許多候選多肽疫苗已經(jīng)進(jìn)入臨床研究。

二 多肽在尋找新藥方面提供了多樣性
治療性多肽具有很多優(yōu)點，包括高活性、良好的化學(xué)和生物多樣性以及低毒性。此外，與基于蛋白質(zhì)的生物制劑相比，固相多肽合成的發(fā)展可以促進(jìn)定制多肽的高效合成，并且使其具有高純度和低成本的特點，還可以大大改善其功能性，提高定制多肽的抗降解性。這些優(yōu)勢正在推動一個動態(tài)多肽藥物發(fā)現(xiàn)過程，旨在治療一系列疾病，包括代謝疾病、癌癥、心血管和傳染病、疼痛和血液病等。接下來，簡單舉幾個治療多肽研究的多樣性實例。

01 門控修飾毒素（GMTs）用于非阿片類鎮(zhèn)痛——尋找能特異性阻斷參與疼痛信號傳導(dǎo)的離子通道的新型肽類鎮(zhèn)痛藥

圖 9 研究中使用的九個GMT的結(jié)構(gòu)和多肽序列

門控修飾毒素（GMTs）是從蜘蛛和其他有毒生物中分離出來的毒性衍生多肽，可調(diào)節(jié)與疾病相關(guān)的電壓門控離子通道的活性，因此可以作為治療的線索，也是研究生理學(xué)和電壓門控離子通道的藥理學(xué)的重要“探針”。

02 穩(wěn)定表位的環(huán)肽支架——環(huán)肽的設(shè)計有助于以受限制的形式呈現(xiàn)表位，該表位也能抵抗蛋白水解

圖 10  MCoTI-I與VHH納米體的結(jié)合（A）MCoTI環(huán)肽和MCoTI-HA環(huán)肽序列；（B）VHH多肽修飾策略圖

環(huán)肽是植物衍生的環(huán)狀肽，由于其高度限制的結(jié)構(gòu)可以抵抗蛋白水解。包括首尾循環(huán)主干和三個二硫鍵形成胱氨酸打結(jié)的核心，這種結(jié)構(gòu)可以使得它們作為支架，多肽序列（表位）可以移植到支架上。VHH7是一種羊駝衍生的納米體，靶向小鼠II類MHC分子，用于靶向向抗原呈遞細(xì)胞（APC）遞送環(huán)肽。分離的環(huán)肽MCoTI-I缺乏固有免疫原性，MCoTI-I與VHH7的結(jié)合顯著增強了環(huán)肽的免疫原性，為產(chǎn)生抗其他環(huán)肽的抗體打開了大門

03 治療血癌的表觀遺傳學(xué)方法——設(shè)計用于破壞染色質(zhì)調(diào)節(jié)劑與其靶標(biāo)結(jié)合的多肽

圖 11 多肽的設(shè)計

圖 12 通過HA標(biāo)簽的免疫印跡檢測樹脂結(jié)合肽

圖 13 在未標(biāo)記TAT-HA融合肽劑量增加的情況下使用純化的DPY30蛋白和FITC-ASH2L（510–529）多肽進(jìn)行熒光偏振分析（FPA）

DPY30是一種染色質(zhì)調(diào)節(jié)劑，通過直接結(jié)合SET1/MLL復(fù)合物中的ASH2L促進(jìn)H3K4甲基化，并在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中發(fā)揮重要作用。Kushani K. Shah等人開發(fā)了一種基于多肽的策略來特異性靶向DPY30活性。設(shè)計了一種來源于ASH2L的細(xì)胞穿透多肽，DPY30結(jié)合多肽特異性抑制DPY30與ASH2L相互作用并增強H3K4甲基化的活性。用DPY30結(jié)合多肽治療顯著抑制MLL重排白血病和其他MYC依賴性血液癌細(xì)胞的生長。

04 治療性多肽也可以作為抗病毒藥物，通常通過抑制復(fù)制周期來靶向HIV、流感或肝炎。例如過破壞人血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（ACE2）受體和SARS-CoV-2病毒的病毒刺突蛋白之間的相互作用以應(yīng)對目前正在發(fā)生的新冠肺炎疫情。
 

圖 14 從患者分離的SARS-CoV-2病毒顆粒的透射電子顯微照片
 

圖 15 SARS-CoV和宿主細(xì)胞進(jìn)入受體ACE2的一般結(jié)構(gòu)示意圖
 

圖 16 S蛋白和宿主ACE2受體的特寫示意圖
 

圖 17 SARS-CoV S蛋白主要結(jié)構(gòu)域的2D示意圖
 

表格 2 SARS-CoV和SARS-CoV-2開發(fā)中的主要肽治療候選物

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