腦惡性腫瘤又常稱為腦癌，分原發(fā)性和繼發(fā)性兩大類：原發(fā)性腦惡性腫瘤以腦膠質(zhì)瘤最多，是一種起源于腦神經(jīng)膠質(zhì)細胞的腫瘤；繼發(fā)性腫瘤主要是指其他部位的腫瘤轉(zhuǎn)移到腦內(nèi)形成的腦轉(zhuǎn)移性腫瘤，其發(fā)病率約是原發(fā)腫瘤的10倍，肺癌就是常見的原發(fā)癌種之一。
 

2022年11月6日，復(fù)旦大學(xué)腫瘤醫(yī)院金偉教授和曹依群教授團隊在Clin. Transl. Med（IF=8.554）上發(fā)表了題為“Single-cell RNA sequencing reveals cellular and molecular reprograming landscape of gliomas and lung cancer brain metastases”的文章，通過scRNA-seq技術(shù)（BD Rhapsody system）聯(lián)合多重熒光免疫組化（abs50015，Absin），解析了GM和LC細胞的異質(zhì)性，發(fā)現(xiàn)了一組具有特異性分子標記的干細胞樣細胞，對于肺癌腦轉(zhuǎn)移的免疫療法有重要的指導(dǎo)性意義。
 

取樣、測序、分析和組織原位驗證的全流程
 

研究中，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)一部分增殖巨噬細胞簇與不良預(yù)后相關(guān)。氣泡圖顯示了中樞神經(jīng)系統(tǒng)駐留小膠質(zhì)細胞（CNS）以及單核細胞來源的巨噬細胞（MDMs）表達TAMs相關(guān)基因的情況，其中CD163在MDMs高表達，而在CNS顯著低表達。通過小提琴圖分析可得，TOP2A基因在增殖巨噬細胞的分布（后兩列），極端值和中位值都比其他細胞更好。后續(xù)研究團隊通過對TOP2A和CD163進行多重免疫熒光染色在組織蛋白層面驗證了細胞群。
 

癌癥干細胞（CSCs）是會導(dǎo)致癌癥轉(zhuǎn)移和化療或放療耐藥性的細胞亞群。研究團隊通過拷貝數(shù)變異分析鑒定了惡性細胞并劃分為10個惡性上皮細胞亞群，基于CytoTRACE分析和擬時序分析顯示，惡性上皮細胞亞群中Mep_C3和C8分化程度較低，可能包含CSCs。為了證實Mep_C3和_C8在LC組織中的存在，團隊通過多重免疫組化檢測了主要標記物的表達（EPCAM/DKK1/TRIM29），發(fā)現(xiàn)DKK1和TRIM29在這些細胞中特異性富集。
 

總的來說，團隊的研究結(jié)果為小膠質(zhì)細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、ECs和T細胞的特征提供了特別的見解，還發(fā)現(xiàn)了癌癥干細胞的一個子集，這將加深對大腦腫瘤微環(huán)境的理解，從而為精準醫(yī)療的患者管理提供一些改善思路。

多色即多重熒光免疫組化（mIHC），主要原理來自TSA技術(shù)，TSA即酪酰胺信號放大(Tyramide signal amplification)是一類利用辣根過氧化酶（HRP）對靶蛋白或核酸進行高密度原位標記的酶學(xué)檢測方法。該技術(shù)可與高性能染料Alexa Fluor®、傳統(tǒng)熒光染料和比色檢測系統(tǒng)相兼容。
 

TSA主要原理是利用酪胺Tyramide的過氧化物酶反應(yīng)(酪胺鹽在HRP催化H2O2下形成共價鍵結(jié)合位點)，產(chǎn)生大量的酶促產(chǎn)物，該產(chǎn)物能與周圍的蛋白殘基(包括色氨酸、組氨酸和酪氨酸殘基)結(jié)合，這樣在抗原-抗體結(jié)合部位就有大量的生物素沉積，與隨后加入的Streptavidin—HRP/熒光基團結(jié)合，經(jīng)幾次這樣的循環(huán)放大，可以結(jié)合大量的酶分子or熒光基團，結(jié)果使其檢測信號得到幾何級放大。
 

簡單來說，用這種方法做多重熒光染色是利用二抗上帶有的HRP（而不是直接偶聯(lián)熒光素），來催化后續(xù)添加入體系的非活性熒光素。該熒光素在HRP和過氧化氫的作用下被活化，跟臨近蛋白的酪氨酸殘基共價偶聯(lián)，使得蛋白樣品與熒光素穩(wěn)定結(jié)合。然后進行微波處理，前一輪非共價結(jié)合的抗體被洗掉，共價結(jié)合的熒光素還留存在樣品上。再換個一抗來第二輪孵育，周而復(fù)始。等到所有抗體孵育結(jié)束，熒光素都結(jié)合好后，最后去檢測結(jié)果。

TSA多重熒光免疫組化染色示意圖