重組蛋白的常見問題匯總
瀏覽次數(shù):1503 發(fā)布日期:2022-12-14
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1.蛋白為什么要凍干?凍干對蛋白的影響有哪些?
蛋白質(zhì)對熱敏感,凍干能使絕大部分蛋白質(zhì)的活性保留下來,提高蛋白的穩(wěn)定性并延長保存時間,同時降低運費。
2.凍干前為什么向蛋白溶液中加保護(hù)劑?一般凍干保護(hù)劑有哪幾種?
保護(hù)劑是用來在凍干和儲存過程中保護(hù)蛋白的。常用的保護(hù)劑或穩(wěn)定劑有糖類,多元醇,聚合物,表面活性劑,某些蛋白和氨基酸等。我們通常加8%(質(zhì)量比體積)的海藻糖和甘露醇作為凍干保護(hù)劑。海藻糖可明顯阻止蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)改變以及凍干過程中蛋白質(zhì)的伸展和聚集;甘露醇也是一種普遍應(yīng)用的凍干保護(hù)劑和填充劑,可以降低某些蛋白的凍干后聚集情況。
溫馨提示:對于大多數(shù)蛋白,重懸后在4℃僅能短期保存(約1周)。如想長期保存,請先配制成稀釋液(其中必須含有載體蛋白,如0.1% BSA,5%HSA,或10% FBS),然后分裝凍存于-20℃或-80℃。一定要避免反復(fù)凍融,因每次凍融均會引起蛋白的部分失活。
3.如何重構(gòu)凍干粉?
請查看您的貨物隨附的分析證書以獲取有關(guān)重構(gòu)的確切說明,因為并非所有產(chǎn)品都在相同條件下重構(gòu)。一般來說,我們建議使用無菌水進(jìn)行復(fù)溶。將推薦體積的無菌水加入小瓶中,輕輕搖晃以完全溶解蛋白質(zhì)。不要渦旋。
4.為什么我的管內(nèi)幾乎看不見蛋白產(chǎn)品?
蛋白產(chǎn)品中不含載體蛋白或其它添加物(如牛血清白蛋白(BSA),人血清白蛋白(HSA)和蔗糖等,并以最低含鹽量的溶液進(jìn)行凍干時,常常不能形成白色網(wǎng)架結(jié)構(gòu),而是微量的蛋白在凍干過程中沉積在管內(nèi),形成很薄或肉眼不可見的透明蛋白層。
5.應(yīng)如何確定細(xì)胞因子的種屬交叉活性?
1) 除少數(shù)例外,大多數(shù)人類細(xì)胞因子對小鼠細(xì)胞均有活性。
2) 許多小鼠細(xì)胞因子也可作用于人類細(xì)胞,但比活性可能低于對應(yīng)的人類細(xì)胞因子。
3) IL-7等為數(shù)不多的人類細(xì)胞因子作用于小鼠細(xì)胞時比對應(yīng)的小鼠細(xì)胞因子活性更強(qiáng)。
4) 干擾素,GM-CSF, IL-3和IL-4等細(xì)胞因子種屬特異,對非同源細(xì)胞幾乎沒有活性。
5) 相反,成纖維細(xì)胞生長因子(FGFs)和神經(jīng)營養(yǎng)素(neurotrophins)高度保守,在不同動物種屬細(xì)胞上均具有很好的活性。
6.什么是載體蛋白?
載體蛋白如 HSA 或 BSA 用于提高重組蛋白的穩(wěn)定性,并有助于避免產(chǎn)品粘在小瓶壁上。
7.我應(yīng)該如何儲存重組蛋白?
對于長期儲存,蛋白質(zhì)溶液應(yīng)與載體蛋白(例如 0.1% BSA 或 0.1% HSA)分裝保存,并在 -20°C 下冷凍保存。請記住,每個冷凍/解凍循環(huán)都可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性。除非分析證書上另有說明,否則大多數(shù)重組蛋白的保質(zhì)期為一年。如果將它們保存在分析證書上所述的最佳存儲條件下,則提供此保證。
8.如何確定重組蛋白的數(shù)量?為什么我的檢測產(chǎn)生的蛋白質(zhì)數(shù)量與您的結(jié)果不同?
我們通過BCA、SDS-PAGE、HPLC等方法確定重組蛋白的數(shù)量。不同的測定產(chǎn)生不同的量化結(jié)果。有時,如果您進(jìn)行不同的檢測,差異可能會很大。蛋白質(zhì)也有可能在儲存過程中形成聚集體,在重組和離心后導(dǎo)致?lián)p失。我們對每批產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)量控制測試,但是,同一批次中的一些小瓶可能與其他小瓶不同(這種情況很少發(fā)生)。
9.如何區(qū)分重組蛋白、融合蛋白和天然蛋白
重組蛋白是利用基因工程技術(shù)產(chǎn)生的,通常是由轉(zhuǎn)基因動物的乳腺產(chǎn)生,其作為生物制藥在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中作用顯著。利用基因工程技術(shù),可以使哺乳動物本身變成“批量生產(chǎn)藥物的工廠”。方法:是將藥用蛋白基因與乳腺蛋白基因的啟動子等調(diào)控組件重組在一起,通過顯微注射等方法,導(dǎo)入哺乳動物(哺乳動物才會泌乳)的受精卵中,然后,將受精卵送入母體內(nèi),使其生長發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動物。轉(zhuǎn)基因動物進(jìn)入泌乳期后,可以通過分泌的乳汁來生產(chǎn)所需要的蛋白質(zhì)藥品,因而稱為動物乳腺生物反應(yīng)器或乳房生物反應(yīng)器。
融合蛋白又稱為“標(biāo)簽蛋白”,常用的標(biāo)簽有His、GST、Strep標(biāo)簽。融合蛋白是通過DNA重組技術(shù)將要表達(dá)的目的蛋白基因和表達(dá)載體上融合蛋白基因相連,通過這種方式表達(dá)出來的蛋白質(zhì),就是既含有目的基因蛋白又含有融合基因蛋白的重組蛋白。融合蛋白表達(dá)是重組蛋白表達(dá)的一種策略,融合表達(dá)是一種方法。
天然蛋白質(zhì)是在自然界中存在的,不經(jīng)過人工的任何修飾或加工,比如大豆中的蛋白質(zhì)和病毒表面的蛋白質(zhì)。