肺炎鏈球菌（S.pn）是一種革蘭氏陽性菌，被認(rèn)為是病原體誘導(dǎo)的肺炎的最常見原因，同時(shí)也引起呼吸道感染、肺實(shí)質(zhì)炎癥和肺部感染引起的菌血癥。而清肺飲（QFY）是一種我國(guó)傳統(tǒng)中藥配方，因其治療細(xì)菌性肺部感染的出色藥理作用而聞名，但其作用的分子機(jī)制尚不清楚。

在該研究中，研究人員在S.pn感染的小鼠中評(píng)估了清肺飲的體內(nèi)療效，使用基于應(yīng)用4D無標(biāo)記蛋白質(zhì)組學(xué)分析的方法，系統(tǒng)地比較了清肺飲治療前后蛋白質(zhì)表達(dá)的變化，揭示了清肺飲預(yù)防肺炎的分子機(jī)制，為未來開發(fā)新的治療方法以對(duì)抗該疾病和減少抗生素濫用奠定了基礎(chǔ)。

 

文章詳情

中文題目：通過NLRP3/mTOR途徑激活自噬：清肺飲緩解肺炎的潛在機(jī)制

英文題目：Activation of Autophagy Through the NLRP3/mTOR Pathway: A Potential Mechanism for Alleviation of Pneumonia by QingFei Yin

發(fā)表時(shí)間：2022.01

發(fā)表期刊：Oxidative Medicine and Cellular Longevity

影響因子：6.5434

實(shí)驗(yàn)技術(shù)：4D-label free蛋白質(zhì)組學(xué)

DOI：10.3389/fphar.2021.763160.

 

研究概述

研究使用基于高效液相色譜-質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）的方法測(cè)定QFY的化學(xué)成分，然后使用兩種模型評(píng)估QFY對(duì)肺炎的保護(hù)藥理作用：一種是肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的體內(nèi)小鼠模型，另一種是體外溶血素（PLY）誘導(dǎo)的小鼠肺泡衍生MH-S細(xì)胞系模型。值得注意的是，QFY在體內(nèi)和體外均具有顯著的抗肺炎作用。為了進(jìn)一步探討QFY的保護(hù)作用，進(jìn)行了4D無標(biāo)記蛋白質(zhì)組學(xué)分析、病理學(xué)評(píng)估和免疫組織化學(xué)（IHC）分析，以確定QFY保護(hù)中涉及的細(xì)胞途徑。結(jié)果表明，NF-κB/NLRP3和自噬途徑可能有助于QFY保護(hù)相關(guān)的藥理作用。簡(jiǎn)而言之，QFY通過下調(diào)上游NLRP3/mTOR信號(hào)通路事件觸發(fā)自噬，從而改善炎癥損傷。

QFY緩解肺炎的治療機(jī)制概述。QFY通過下調(diào)上游NLRP3/mTOR信號(hào)通路事件觸發(fā)自噬，導(dǎo)致炎癥損傷的改善。

 

研究思路

 

研究?jī)?nèi)容

1、QFY制劑的HPLC色譜圖

本研究鑒定了QFY的19種主要化合物，這19種成分的總離子流（TIC）值如圖所示。對(duì)10批QFY配方進(jìn)行了比較和分析，結(jié)果表明，QFY保留了其四種中藥成分的主要活性成分，且不同批次的制劑具有良好的重現(xiàn)性。

圖1 QFY配方的HPLC色譜圖

 

2、QFY對(duì)肺炎鏈球菌肺炎小鼠模型肺病理和炎性細(xì)胞因子的影響

在用s.pn（2.5×108CFU/毫升）感染48小時(shí)后，制備小鼠肺組織。通過觀察小鼠肺組織的組織學(xué)變化來評(píng)價(jià)QFY在體內(nèi)的保護(hù)作用。小鼠的代表性肺組織學(xué)顯示廣泛的肺炎跡象，觀察到肺組織顏色加深，并伴有間質(zhì)性炎癥、血管炎、支氣管炎和水腫。肺葉充血、腫脹，并有嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的跡象。QFY治療后，肺組織出血和腫脹減少。表明QFY處理的小鼠預(yù)防了S.pn誘導(dǎo)的肺部炎癥損傷。接下來測(cè)量了BALF的炎癥細(xì)胞因子水平，以研究肺炎鏈球菌感染對(duì)肺部炎癥的影響以及QFY對(duì)肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺炎的保護(hù)作用。TNF-α、IL-1β和IL-1β的炎性細(xì)胞因子水平增加，因此，上述數(shù)據(jù)表明，肺炎鏈球菌感染誘導(dǎo)肺部炎癥被QFY療法逆轉(zhuǎn)。

圖2 QFY預(yù)防了感染小鼠的肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺部炎癥損傷

 

3、QFY治療改變S.pn感染小鼠的蛋白表達(dá)

為了揭示QFY減輕肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的小鼠肺炎的精確分子機(jī)制，使用4D無標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析來檢測(cè)QFY處理的肺組織中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。在S.pn組與對(duì)照組中鑒定出655個(gè)差異蛋白質(zhì)，其中433個(gè)蛋白上調(diào)，222個(gè)蛋白下調(diào)。GO功能注釋結(jié)果表明，免疫和細(xì)胞因子產(chǎn)生的調(diào)節(jié)、對(duì)細(xì)菌的反應(yīng)和防御反應(yīng)注釋到。與S.pn感染組相比，QFY處理組中有345種蛋白質(zhì)差異表達(dá)。正如預(yù)期的那樣，相對(duì)于上述其他過程，這些差異表達(dá)的蛋白質(zhì)在病原體感染期間顯著富集。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明QFY顯著逆轉(zhuǎn)了S.pn誘導(dǎo)的宿主防御和免疫反應(yīng)的改變。

圖3 組分類和GO功能注釋

 

4、QFY治療通過NOD樣受體和自噬信號(hào)通路減輕S.pn誘導(dǎo)的肺炎

為了進(jìn)一步研究肺炎鏈球菌感染期間的QFY靶和QFY作用機(jī)制，進(jìn)行了基于KEGG的差異表達(dá)蛋白的生物學(xué)分析。36和13個(gè)差異蛋白分別富含NOD樣受體和自噬信號(hào)通路。使用蛋白質(zhì)印跡和免疫組織化學(xué)(IHC)，進(jìn)一步驗(yàn)證代表性差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。NLRP3和NF-κB信號(hào)通路共同參與細(xì)胞因子的釋放，從而證實(shí)了上述信號(hào)通路中其他代表性蛋白的參與。自噬已經(jīng)成為病原體入侵期間維持宿主體內(nèi)平衡的重要過程，mTOR依賴性自噬被抑制，正如在S.pn感染后48小時(shí)mTOR磷酸化和p62積聚所證明的那樣。對(duì)上述數(shù)據(jù)的證實(shí)表明，QFY通過下調(diào)NLRP3的水平和糾正有缺陷的自噬來減輕S.pn誘導(dǎo)的肺炎。研究人員推測(cè)，即使沒有直接暴露于完整的肺炎鏈球菌，QFY也可能在體內(nèi)發(fā)揮類似的保護(hù)作用，這促使作者通過研究PLY處理的MH-S細(xì)胞作為體外肺炎模型來檢驗(yàn)這一假設(shè)。

圖4 QFY改變NOD樣受體和自噬信號(hào)通路的表達(dá) 圖5 對(duì)照組、S.pn組和S.pn+QFY組（0.42g/kg）小鼠肺組織中與NLRP3組分、自噬途徑相關(guān)的關(guān)鍵蛋白表達(dá)的驗(yàn)證（A，B）和IHC（C，D）

 

5、QFY對(duì)PLY誘導(dǎo)的MH-S細(xì)胞的影響

為了進(jìn)一步探索QFY保護(hù)性減輕S.pn感染是否與NLRP3下調(diào)（以及自噬激活）有關(guān)，作者研究了PLY處理的MH-S細(xì)胞中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)水平。MH-S細(xì)胞用PLY（400 ng/ml）和低劑量（25μg/ml）或高劑量（50μg/ml）和QFY共處理24小時(shí)。與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，PLY誘導(dǎo)NLRP3、ASC和裂解的casp1蛋白水平的增加，同時(shí)檢測(cè)到功能失調(diào)的自噬。重要的是，據(jù)報(bào)道NLRP3和自噬途徑通過相互調(diào)節(jié)聯(lián)系在一起，這些觀察啟發(fā)作者進(jìn)一步探索涉及NLRP3和自噬途徑的雙向調(diào)節(jié)機(jī)制，并確定QFY靶點(diǎn)。

圖6 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)蛋白表達(dá)

 

6、QFY通過下調(diào)上游NLRP3\/mTOR途徑激活自噬

越來越多的證據(jù)表明，NLRP3表達(dá)的上調(diào)依賴于NF-κB通路的激活。同時(shí)，NLRP3作為mTOR的結(jié)合伴侶，參與抑制自噬的NLRP3-mTOR復(fù)合物的形成。作者進(jìn)行了Spearman相關(guān)分析來評(píng)估NLRP3途徑蛋白水平和自噬之間的潛在聯(lián)系。有趣的是，在自噬和凋亡之間觀察到了高度顯著的正相關(guān)。相反，NLRP3、ASC和caspase-1水平與p-mTOR/mTOR和p62水平顯著正相關(guān)，與p-mTOR/mTOR和p62水平顯著負(fù)相關(guān)，與LC3BII/I和p-ULK/ULK水平相關(guān)�？傊�，這些發(fā)現(xiàn)表明肺炎的發(fā)展伴隨著自噬的阻斷，NLRP3和自噬途徑彼此負(fù)相關(guān)。接下來，MH-S細(xì)胞對(duì)PLY刺激(400ng/ml)的反應(yīng)通過從6至48小時(shí)進(jìn)行的時(shí)間過程實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究。在感染后6小時(shí)，NLRP3和ASC的蛋白表達(dá)水平?jīng)]有顯著變化。然而，在持續(xù)感染48小時(shí)后，NLRP3和ASC的表達(dá)比它們各自的基礎(chǔ)水平增加了3倍多。QFY治療顯著下調(diào)了NLRP3途徑成分，也修復(fù)了缺陷性自噬�？傊�，QFY抗肺炎鏈球菌作用似乎與通過下調(diào)涉及NLRP3/mTOR的上游自噬途徑事件激活自噬有關(guān)。

圖7 （A）自噬和NLRP3信號(hào)通路的Spearman相關(guān)分析。（B）MH-S細(xì)胞對(duì)PLY刺激（400納克/毫升）的反應(yīng)通過刺激后6至48小時(shí)進(jìn)行的時(shí)間過程實(shí)驗(yàn)進(jìn)行探索。蛋白質(zhì)在（C，D）中定量，數(shù)據(jù)以每組（n=3）的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，*p<0.05，**與對(duì)照組相比p<0.01。 圖8 QFY通過下調(diào)上游NLRP3\/mTOR途徑激活自噬

 

研究結(jié)論

總之，該結(jié)果表明，NLRP3通過結(jié)合mTOR抑制自噬，而QFY通過下調(diào)NLRP3逆轉(zhuǎn)感染受損的自噬。這項(xiàng)研究為今后研究QFY和其他中草藥治療肺部感染性疾病的確切靶點(diǎn)和機(jī)制提供了理論依據(jù)。