植物成像應(yīng)用：過氧化氫感受器過程中所使用的鈣成像方法研究

瀏覽次數(shù)：6903　發(fā)布日期：2022-11-21　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

在上篇技術(shù)通訊文章中，我們報(bào)道了裴真明課題組于2020年2月發(fā)表于Nature的突破性研究成果（點(diǎn)擊此處閱讀），研究人員首次發(fā)現(xiàn)了位于植物細(xì)胞表面的過氧化氫感受器（hydrogen-peroxide-induced Ca^{2 +}increases 1），并揭示了其通過共價(jià)修飾胞外結(jié)構(gòu)以響應(yīng)細(xì)胞外H2O2的刺激并激活下游信號(hào)通路的分子機(jī)制，這是目前所發(fā)現(xiàn)的唯一具有此類特性的受體或感受器，使得人們對(duì)于植物環(huán)境感受和信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制的認(rèn)識(shí)更進(jìn)一步。
（注：因HPCA1屬于LRR-RK受體激酶亞家族，在上篇文章中，我們并未對(duì)其在“受體”或“感受器”上的稱呼做嚴(yán)格限定，鑒于相關(guān)植物學(xué)研究領(lǐng)域老師的指正，我們遵照裴老師文章中出現(xiàn)頻率較多的sensor這一描述，將HPCA1稱為過氧化氫的“感受器”或“傳感器”，特此說明。）
在本篇文章中，我們從原文的龐大實(shí)驗(yàn)體系中重點(diǎn)選取與細(xì)胞內(nèi)Ca2+成像相關(guān)的實(shí)驗(yàn)與發(fā)現(xiàn)為大家做詳細(xì)介紹，以期可以為進(jìn)行類似研究的老師們提供思路和方法學(xué)上的參考。
eH2O2誘導(dǎo)的[Ca2 +] i增加缺陷型突變體（hpca1）的篩選實(shí)驗(yàn)過程中，研究人員使用基于Ca2+成像的正向遺傳篩選法，對(duì)植物體內(nèi)的胞漿鈣濃度（[Ca2 +] i）進(jìn)行測(cè)量，進(jìn)而分離得到eH2O2誘導(dǎo)的[Ca2 +] i增加缺陷型突變體（hpca1），用于后續(xù)研究。具體的實(shí)驗(yàn)過程如下：
使用組成型表達(dá)細(xì)胞內(nèi)Ca2 +指示劑水母發(fā)光蛋白（pMAEQUORIN2）的Col-0品系擬南芥植株，于成像前12h均勻地施加3 ml 10 µM腔腸素（水母發(fā)光蛋白的作用底物）。篩選出可穩(wěn)定表達(dá)水母發(fā)光蛋白的M2種子后，對(duì)培養(yǎng)的幼苗使用4 mM H₂O₂處理3min，在此期間連續(xù)進(jìn)行水母發(fā)光蛋白的信號(hào)采集（Ca2+成像），進(jìn)而篩選出對(duì)H₂O₂所誘導(dǎo)的[Ca2 +] i增加不敏感的擬南芥幼苗，作為hpca突變體候選株進(jìn)行單獨(dú)收集。

圖1 | H2O2誘導(dǎo)的Ca 2+增加缺陷型擬南芥突變體的篩選。與野生型幼苗相比，在明場(chǎng)中觀察時(shí)，hpca1幼苗沒有表現(xiàn)出明顯的形態(tài)改變或發(fā)育表型上的特征；使用H2O2處理后，發(fā)現(xiàn)hpca1幼苗的生物發(fā)光明顯減弱，即[Ca2 +] i降低，說明hpca1對(duì)于H2O2的響應(yīng)存在缺陷。

擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖1：
對(duì)照實(shí)驗(yàn)：將圖1a中使用的野生型和hpca1擬南芥幼苗，用含有0.9 M CaCl2和10％（v / v）乙醇的溶液處理（刺激水母發(fā)光蛋白發(fā)光），對(duì)剩余的發(fā)光總量進(jìn)行成像以及定量。結(jié)果顯示，野生型和hpca1幼苗中的水母發(fā)光蛋白總量相似，說明圖1a中，hpca1幼苗的生物發(fā)光減弱與其水母發(fā)光蛋白的含量無關(guān)，確實(shí)是由于對(duì)H2O2的響應(yīng)存在缺陷而導(dǎo)致。
與其他兩類突變體相比，hpca1突變體對(duì)H2O2具有特異性
為了確定hpca1突變體與已知的滲透壓osca1和鹽敏感型moca1突變體相比，對(duì)H2O2具有特異性，研究人員將它們并排生長(zhǎng)并檢查其各自的Ca2 +表型。

擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖2：hpca1，osca1，moca1突變體以及野生型擬南芥與Ca2 +相關(guān)的表型。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，對(duì)于eH2O2誘導(dǎo)的[Ca2 +] i增加，osca1、moca1和野生型幼苗相似；而對(duì)于山梨糖醇或NaCl誘導(dǎo)的[Ca2 +] i增加而言，hpca1和野生型幼苗相似，表明hpca1與osca1（滲透壓）和moca1（鹽脅迫）不同，具有eH2O2特異的Ca2 +表型。
驗(yàn)證hpca1基因的突變是導(dǎo)致eH2O2感知缺陷的原因
利用全基因組重測(cè)序的方法對(duì)HPCA1進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)其為一種富含亮氨酸的重復(fù)受體激酶（LRR-RK）。為了證明hpca1基因的突變是導(dǎo)致eH2O2感知缺陷的原因，研究人員將HPCA1和hpca1突變體進(jìn)行互補(bǔ)性重組，并對(duì)重組后的幼苗用4mMH₂O₂處理后進(jìn)行Ca2+成像，結(jié)果表明HPCA1可以“拯救”hpca1突變體表型，說明hpca1正是導(dǎo)致缺陷型的基因。

圖2 | HPCA1蛋白可對(duì)hpca1-1表型缺陷進(jìn)行補(bǔ)充。
HPCA1是否適用于其他LRR-RK傳導(dǎo)機(jī)制的探究
另一方面，研究人員想要探究HPCA1對(duì)于H2O2是否具有特異性，或HPCA1是否更普遍地適用于其他LRR-RK傳導(dǎo)機(jī)制——感知生物刺激并觸發(fā)NADPH氧化酶介導(dǎo)的H2O2生成。
鞭毛蛋白肽flg22和延伸因子Tu（EF-Tu）衍生的肽elf18和elf26都是與微生物相關(guān)的分子模式（MAMPs）。在先天性免疫中，MAMPs的受體通常是受體激酶，如LRR-RKs、FLS2和EFR分別是flg22和elf18-elf26的受體。flg22和elf18-elf26均可引起[Ca2 +] i增加，這在其相應(yīng)的受體突變體fls2和efr中則被消除。
研究人員分析了HPCA1是否可以區(qū)分MAMPs處理后產(chǎn)生的H2O2，發(fā)現(xiàn)在hpca1突變體中，由flg22觸發(fā)的[Ca2 +] i增加不受影響。FLS2及其共受體BAK1的突變體對(duì)flg22觸發(fā)的[Ca2 +] i增加表現(xiàn)出缺陷，但對(duì)于eH2O2誘導(dǎo)的[Ca2 +] i增加則表現(xiàn)出野生型水平。

擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖3：野生型、hpca1突變和fls2突變幼苗的Ca2+成像及定量分析，結(jié)果顯示flg22觸發(fā)的[Ca2 +] i增加在hpca1突變體中不受影響。

擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖4：野生型、hpca1突變和bak1突變幼苗的Ca2+成像及定量分析，結(jié)果顯示FLS2的共受體BAK1的突變體對(duì)于eH2O2誘導(dǎo)的[Ca2 +] i增加表現(xiàn)出野生型水平。
考慮到保衛(wèi)細(xì)胞中抗過氧化氫1（ghr1）突變體在eH2O2和ABA信號(hào)傳導(dǎo)中均表現(xiàn)出強(qiáng)表型，研究人員對(duì)hpca1和ghr1突變體也進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)eH2O2誘導(dǎo)的[Ca2 +] i增加在ghr1突變體中不受影響。

擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖5：野生型、hpca1突變和ghr1突變幼苗的Ca2+成像及定量分析，各組幼苗并排生長(zhǎng)并用4 mM H2O2處理。
這些結(jié)果表明，保衛(wèi)細(xì)胞中的eH2O2信號(hào)傳導(dǎo)涉及多個(gè)LRR-RK，HPCA1可能是GHR1上游的eH2O2傳感器。
HPCA1的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域具有激酶活性

為確定HPCA1的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域（HPCA1CD）是否具有激酶活性或僅充當(dāng)支架結(jié)構(gòu)，研究人員準(zhǔn)備了野生型HPCACD以及三種無活性的激酶突變體：HPCA1（K659E）CD——與ATP結(jié)合相關(guān)，HPCA1（D773L）CD——與催化相關(guān)，HPCA1（Q856 *）CD——結(jié)構(gòu)域被截短。

圖3 | HPCA1激酶突變體的各突變位點(diǎn)示意圖。
利用這三種激酶突變體構(gòu)建的HPCA1與hpca1-2突變植株進(jìn)行互補(bǔ)性重組，發(fā)現(xiàn)這些激酶突變體不能恢復(fù)hpca1-2的表型，說明HPCA1的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域（HPCA1CD）發(fā)揮激酶活性的作用。

胞外Cys殘基對(duì)對(duì)于HPCA1感應(yīng)eH2O2必不可少
HPCA1在其胞外區(qū)域具有2個(gè)特殊的Cys殘基對(duì)，為了探究這2個(gè)殘基對(duì)的作用，研究人員使用Cys突變的HPCA1對(duì)hpca1突變體進(jìn)行互補(bǔ)重組，對(duì)重組后的樣本使用4mM H₂O₂處理。
Ca2+成像結(jié)果顯示，Cys突變的HPCA1無法恢復(fù)hpca1-2突變體的表型，說明胞外Cys殘基對(duì)對(duì)于感應(yīng)eH2O2是必不可少的。

圖5 | Cys突變的HPCA1 × hpca1-2突變體中，Ca2+成像發(fā)光信號(hào)大幅度減弱，即Cys突變的HPCA1無法恢復(fù)hpca1-2突變體的表型。

擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖6：
對(duì)照實(shí)驗(yàn)：將圖5e中使用的各組擬南芥幼苗，用含有0.9 M CaCl2和10％（v / v）乙醇的溶液處理（刺激水母發(fā)光蛋白發(fā)光），對(duì)剩余的發(fā)光總量進(jìn)行成像。對(duì)于所有基因型，檢測(cè)到相似的發(fā)光強(qiáng)度。說明圖5e中Cys突變的HPCA1 × hpca1-2突變體的發(fā)光信號(hào)大幅度減弱與其水母發(fā)光蛋白的含量無關(guān)，而是由于其對(duì)H2O2的響應(yīng)存在缺陷而導(dǎo)致。
基于水母發(fā)光蛋白生物發(fā)光的Ca2+成像過程由配備了不透光暗箱的超低溫背照式CCD相機(jī)（ChemiPro HT系統(tǒng)）以及配備了H-800不透光可控環(huán)境箱的新型Lumazone系統(tǒng)（(Pylon1300B）完成。將液氮自動(dòng)填充系統(tǒng)連接到成像系統(tǒng)以提供恒定的冷卻溫度。CCD相機(jī)由WinView軟件控制，并使用MetaMorph 6.3等軟件進(jìn)行生物發(fā)光圖像的分析。
注：ChemiPro HT系統(tǒng)、Lumazone Pylon1300B系統(tǒng)、液氮自動(dòng)填充系統(tǒng)以及WinView控制軟件均由Roper Scientific以及Bio-One Scientific Instrument（博益科學(xué)儀器）提供。
H-800不透光可控環(huán)境箱由Bio-One Scientific Instrument（博益科學(xué)儀器）獨(dú)家研發(fā)，適用于植物活體成像過程中對(duì)于實(shí)驗(yàn)植株的培養(yǎng)與拍攝，可控制溫度和光照強(qiáng)度，提供穩(wěn)定均一的生長(zhǎng)和實(shí)驗(yàn)條件。
MetaMorph 6.3（Molecular Devices, USA）等圖像分析軟件由Bio-One Scientific Instrument（博益科學(xué)儀器）提供。
設(shè)備使用期間，由北京博益?zhèn)I(yè)儀器有限公司負(fù)責(zé)提供鈣離子成像、圖像分析軟件、環(huán)境控制培養(yǎng)箱、CCD液氮制冷裝置等相關(guān)部分的技術(shù)支持和售后服務(wù)工作。
除了采用基于水母發(fā)光蛋白生物發(fā)光的Ca2 +成像技術(shù)進(jìn)行相關(guān)研究外，研究人員在實(shí)驗(yàn)過程中還采用了基于黃色Cameleon 3.6（YC3.6）的Ca2+成像方法，用以評(píng)估hpca1突變體中保衛(wèi)細(xì)胞eH2O2 Ca2+信號(hào)傳導(dǎo)受損的情況。實(shí)驗(yàn)方法描述如下：
將hpca1突變體雜交到組成型表達(dá)Ca2 +傳感器YC3.6的野生型植株中并進(jìn)行Ca2 +成像，對(duì)產(chǎn)生的五個(gè)以上的純和品系進(jìn)行分析。之后，將來自三周齡植株的蓮座葉表皮置于含有100μM CaCl2、5 mM KCl和10 mM MES-Tris（pH 6.15）的微孔室中，在光照下放置2.5 h。
使用配備有兩個(gè)濾光輪（Lambda 10-3 / 10-2）和低溫CMOS或CCD相機(jī)（Prime sCMOS / CoolSNAPfx）的熒光顯微鏡進(jìn)行比率式Ca2 +成像。在440 nm處進(jìn)行激發(fā)，并使用MetaFluor軟件（Molecular Devices）收集發(fā)射比率為F535 nm / F485 nm的圖像。
考慮到eH2O2觸發(fā)了保衛(wèi)細(xì)胞中[Ca2 +] i的增加和氣孔的關(guān)閉，實(shí)際檢測(cè)時(shí)，確實(shí)可以在hpca1突變體中觀察到保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)的eH2O2 Ca2 +信號(hào)降低，并且響應(yīng)eH2O2的氣孔關(guān)閉數(shù)量減少。
這些結(jié)果表明，在hpca1突變體的保衛(wèi)細(xì)胞中，eH2O2所誘導(dǎo)的Ca2 +信號(hào)通路存在明顯缺陷。

圖6 | a：在加入2 mM H2O2之前的20秒和之后的140秒，每4秒鐘拍攝一次表達(dá)YC3.6的植株中表皮條的比例圖像。b：根據(jù)a中實(shí)驗(yàn)的時(shí)間進(jìn)程，對(duì)[Ca2 +] i進(jìn)行量化分析。
注：低溫Prime sCMOS相機(jī)、CoolSNAPfx CCD相機(jī)（Photometrics, USA）和MetaFluor軟件（Molecular Devices, USA）均由Bio-OneScientific Instrument（博益科學(xué)儀器）提供。
設(shè)備使用期間，由北京博益?zhèn)I(yè)儀器有限公司負(fù)責(zé)提供相應(yīng)的技術(shù)支持和售后服務(wù)工作。
總結(jié)：
作為生物體內(nèi)一種重要的信號(hào)傳導(dǎo)介質(zhì)，Ca2+具有獨(dú)特的生物學(xué)功能，參與多種細(xì)胞對(duì)于外部刺激的感應(yīng)以及內(nèi)部分子事件的調(diào)控過程。裴真明教授課題組的研究人員，采用基于生物發(fā)光蛋白（水母發(fā)光蛋白）以及熒光蛋白鈣指示劑（YC3.6）的Ca2+成像方法，完成了在發(fā)現(xiàn)植物細(xì)胞表面過氧化氫感受器HPCA1過程中所涉及的多項(xiàng)探究任務(wù)，如利用正向遺傳篩選法分離得到突變體植物、驗(yàn)證目標(biāo)植株、目標(biāo)基因和目標(biāo)蛋白的特異性等。成像方法的應(yīng)用，使得結(jié)論的得出及證明過程更加簡(jiǎn)便、高效和直觀。因此，我們特意梳理出上述涉及Ca2+成像的實(shí)驗(yàn)方法與大家做交流，希望從事相關(guān)植物學(xué)研究的老師們可以對(duì)這些技術(shù)方法有更進(jìn)一步的了解，對(duì)于今后開展相關(guān)研究有所助益。

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