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熒光定量PCR基礎(chǔ)知識(shí)小課堂(一)

瀏覽次數(shù):2787 發(fā)布日期:2022-11-4  來源:本站 僅供參考,謝絕轉(zhuǎn)載,否則責(zé)任自負(fù)

01 常規(guī)PCR和熒光定量PCR的區(qū)別是什么呢?
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR):一種對(duì)特定的靶核酸片段在體外進(jìn)行快速擴(kuò)增的方法。通常由變性—退火—延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成,通過不同溫度的循環(huán)實(shí)現(xiàn)靶核酸的擴(kuò)增。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR (Real-time qPCR) 是在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的核酸/基因檢測(cè)技術(shù),是一種在PCR反應(yīng)體系中加入熒光標(biāo)記探針或熒光染料,通過采集熒光信號(hào)出現(xiàn)的先后順序以及強(qiáng)弱的變化,搭配軟件分析Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線,對(duì)目的基因進(jìn)行定性或定量分析的方法。


02 熒光定量PCR反應(yīng)體系的組成都有什么呢?
熒光定量PCR反應(yīng)體系包括:核酸模板、引物、熱穩(wěn)定DNA聚合酶、四種dNTP、熒光染料或Taqman探針以及含有Mg2+ 等的緩沖液。一般配置20μL或50μL體積的反應(yīng)體系。

核酸模板
通常配置20 μL反應(yīng)體系時(shí),模板的使用量小于100 ng,逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板時(shí),模板量不超過體系終體積的20%。模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn),常用于基因表達(dá)的檢測(cè),在材料收集過程中,樣本需要立刻液氮速凍,并迅速轉(zhuǎn)移到超低溫冰箱保存,盡量避免RNA的降解。一般將實(shí)驗(yàn)材料分為對(duì)照組和處理組,組內(nèi)要有3組以上重復(fù),以便后續(xù)對(duì)偏差較大的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。


DNA聚合酶
在進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)時(shí),需要選擇合適的耐熱聚合酶,具體需參考酶的特異性、保真性、耐熱性、擴(kuò)增速率等多個(gè)指標(biāo)。目前市面上較常用的是Taq DNA聚合酶,其他還有Vent系列、KOD系列、Pfu系列等多種類型的DNA聚合酶。


引物
是指人工合成的兩段寡核苷酸序列,其中一個(gè)引物與對(duì)應(yīng)的DNA模板鏈目標(biāo)區(qū)域3’端的堿基互補(bǔ),另一個(gè)引物與另一條DNA模板鏈目標(biāo)區(qū)域5’端的堿基互補(bǔ)。


脫氧核苷三磷酸(dNTP)
dNTPs是dATP、dGTP、dTTP、dCTP的統(tǒng)稱。dNTPs作為DNA復(fù)制原料,它直接影響擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)量、特異性以及保真性,因此在實(shí)驗(yàn)過程中需要選擇濃度準(zhǔn)確、純度高的試劑。


緩沖液
緩沖液的作用是為DNA聚合酶活性提供適宜的化學(xué)環(huán)境。通常緩沖液的pH為8.0-9.5,改變pH會(huì)影響核酸擴(kuò)增量。另外緩沖液的關(guān)鍵組分Mg2+是酶工作所必需的離子,與 dNTPs 和模板螯合在一起,成為 DNA 聚合酶識(shí)別的底物。目前市面上的常用的緩沖液一般是2×的濃縮液,按照說明書的添加量配置即可。


熒光團(tuán)基
熒光化學(xué)物質(zhì)可分為:熒光染料和熒光探針。
熒光染料以SYBR Green為代表,與DNA小溝區(qū)域非特異性結(jié)合,每形成一條雙鏈,就有染料與雙鏈DNA結(jié)合。通過光源激發(fā)染料產(chǎn)生熒光信號(hào),熒光信號(hào)強(qiáng)弱與DNA雙鏈數(shù)量成正比。
熒光探針的發(fā)光機(jī)制與染料不同,利用的是一對(duì)能產(chǎn)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移的基團(tuán),即5′端的報(bào)告基團(tuán)和3′端的淬滅基團(tuán)。探針完整時(shí),報(bào)告基團(tuán)的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)所淬滅,擴(kuò)增時(shí),5'端外切酶活性將探針?biāo)馇懈睿瑘?bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離,熒光信號(hào)開始積累。
 


總的來說,熒光定量PCR作為核酸定量常用的檢測(cè)方法,體系配置簡(jiǎn)單,適用范圍廣泛。在進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)時(shí),不管是選擇熒光染料還是熒光探針,檢測(cè)方法都很有效,可以根據(jù)本身材料情況,選擇適合的方法。
 


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