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µ-Slide 8孔細(xì)胞培養(yǎng)皿在免疫熒光染色I(xiàn)F和高分辨率顯微適配的應(yīng)用

瀏覽次數(shù)：1580　發(fā)布日期：2022-10-17　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

µ-Slide 8 孔高壁進(jìn)行免疫熒光染色

免疫熒光 (IF) 是使用顯微鏡深入了解細(xì)胞結(jié)構(gòu)和過程的有效方法。這種方法可以評估特定蛋白質(zhì)的表達(dá)和位置，使得免疫熒光對于科學(xué)家解決許多細(xì)胞生物學(xué)問題是必不可少的。

下面我們介紹了一體化簡單的方法，用于在 µ-Slide 8 孔高壁中培養(yǎng)和免疫熒光染色粘附的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 (HUVEC)

請注意：在開始細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)之前，需要檢查幾個(gè)重要參數(shù)，例如目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平、最佳細(xì)胞密度以及理想的細(xì)胞培養(yǎng)容器幾何形狀和底物/涂層。此外，還應(yīng)評估最佳抗體稀釋度。此外，陽性和陰性對照是驗(yàn)證 IF 染色所必需的。因此，我們強(qiáng)烈建議在實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行徹底的文獻(xiàn)研究。

1. 材料

1.1. 試劑和緩沖液

細(xì)胞培養(yǎng)

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC、C-12203、Promocell）
膠原蛋白 IV（354233，康寧）
0.05M HCl (X942.1, Carl Roth)
細(xì)胞培養(yǎng)基：內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基（C-22210，Promocell）和內(nèi)皮細(xì)胞生長培養(yǎng)基補(bǔ)充混合物（C-39215，Promocell）
PBS（14190144，Gibco）
精氨酸酶（A1110501，Gibco）

免疫熒光染色

PBS（14190144，Gibco）
福爾馬林，10%，即用型（HT5011，Sigma Aldrich）
單克隆抗 α-微管蛋白（T5168，Sigma Aldrich）
抗小鼠 IgG-Atto 594 (76085 Sigma Aldrich)
鬼筆環(huán)肽 488 偶聯(lián)物（ab176753，Abcam）
使用DAPI 的ibidi 抗熒光淬滅劑（50011，同上）
Triton-X-100（A16046，賽默飛世爾科技）
穿透緩沖液（PBS 中0.5% Triton-X-100）
封閉緩沖液（PBS 中1% BSA + 0.2% Triton X 100）
抗體稀釋緩沖液（1% BSA + 0.05% Triton X 100 的PBS 溶液）
牛血清白蛋白 (BSA) (A1470-10G, Sigma Aldrich)
ibidi浸油（50101，同上）

1.2. 設(shè)備

µ-Slide 8 孔高壁，ibiTreat（80806，同上）
µ-載玻片架（80003，同上）
標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備（移液器、無菌工作臺(tái)、細(xì)胞培養(yǎng)箱、培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)基、血細(xì)胞計(jì)數(shù)器等）
帶有適當(dāng)濾光片組的倒置熒光顯微鏡

2.方法

2.1.細(xì)胞培養(yǎng)

使用前請閱讀說明µ-Slide 8 孔高壁，ibiTreat.在無菌條件下執(zhí)行所有步驟。在開始實(shí)驗(yàn)之前，在標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)瓶中制備 HUVEC（例如，T75，在0.05 M HCl 中涂有 6.7 µg/ml 膠原蛋白IV 1 小時(shí)），細(xì)胞粘附在底部。細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天應(yīng)該是健康的并且最佳次匯合。

在整個(gè)過程中快速工作很重要，這樣孔里就不會(huì)變干。

如果沒有另外說明，所有給定的體積都是每孔的，所有的孵育步驟都是在室溫下進(jìn)行的。

•用 Accutase 處理培養(yǎng)的 HUVEC 1-2 分鐘以進(jìn)行分離。

•收集細(xì)胞懸液，離心，用少量培養(yǎng)基稀釋后進(jìn)行計(jì)數(shù)；量取決于所需的細(xì)胞濃度。

•計(jì)數(shù)細(xì)胞，在內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基和內(nèi)皮細(xì)胞生長培養(yǎng)基補(bǔ)充混合物中，并調(diào)整到最終濃度為 2 x 105cells/ml 。

•打開 ibidi µ-Slide 8 Well高壁的包裝并將其放在 µ- Slide Rack 或適當(dāng)?shù)谋砻嫔稀?/span>

•在每個(gè)孔中加入 250µl 的 HUVEC 懸浮液。

•蓋上隨附的蓋子。

•將載玻片與支架一起放入培養(yǎng)箱（37°C，5% CO2）中，讓細(xì)胞附著至少 3 小時(shí)或過夜。

•對于延長細(xì)胞培養(yǎng)，我們建議每隔一天更換一次培養(yǎng)基。

2.2.固定、通透和封閉

•為您的實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備足夠的穿透緩沖液和封閉緩沖液。

•使用細(xì)胞培養(yǎng)吸液裝置從孔中吸出細(xì)胞培養(yǎng)基。

•用 PBS清洗細(xì)胞：將 200 µl PBS 緩慢加入每個(gè)孔中并吸出。

•用 200µl 福爾馬林 (10%) 固定細(xì)胞 10 分鐘。

•去除福爾馬林并用 200µl PBS 洗滌細(xì)胞 3 次。

•將細(xì)胞在 200µl 穿透緩沖液中孵育 10 分鐘。

•去除穿透緩沖液并用 200μL PBS 清洗細(xì)胞。

•用 200µl 封閉緩沖液封閉 30 分鐘。

2.3.染色和封片

在封閉步驟中，準(zhǔn)備足夠的抗體稀釋緩沖液來稀釋一抗和二抗。
在抗體稀釋緩沖液中稀釋一抗（α-微管蛋白：1:200稀釋）。
將細(xì)胞在 150µl 一抗溶液中孵育 2 小時(shí)（請注意，許多抗體需要在 4°C 下過夜孵育）。
用 200 µl Blocking Buffer 清洗兩次。
在相同的抗體稀釋緩沖液中稀釋二抗和鬼筆環(huán)肽（anti-mouse-IgGAtto 594：1:200 稀釋度；鬼筆環(huán)肽 488 偶聯(lián)物 1:1000 稀釋度）。
在黑暗中將細(xì)胞在 150 µl 的二抗溶液中孵育 2 小時(shí)。從此時(shí)起，樣品應(yīng)盡可能保存在黑暗中
用 200 µl Blocking Buffer 清洗兩次
清空所有孔。