ArrayJet芯片點(diǎn)樣技術(shù)助力蛋白芯片尋找潛在的生物標(biāo)志物
 

Andreas Weinhäusel，維也納自然資源與應(yīng)用生命科學(xué)大學(xué)教授，同時(shí)在奧地利理工學(xué)院健康和生物資源中心從事分子診斷研究，于2022年3月對(duì)其研究進(jìn)展進(jìn)行了在線Webinar報(bào)告，內(nèi)容涉及DNA甲基化以及自身抗體相關(guān)的生物標(biāo)記物發(fā)現(xiàn)、生物傳感器研發(fā)、生物信息學(xué)分析、分子診斷等方面，充分利用高通量的蛋白芯片、多肽芯片這一技術(shù)手段。

分析臨床組織，血液，唾液等樣本中DNA、RNA以及蛋白的表達(dá)情況對(duì)預(yù)測(cè)疾病的發(fā)展階段，明確治療方向具有重要意義。其中DNA異常甲基化與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、細(xì)胞癌變有著密切的聯(lián)系，多肽結(jié)構(gòu)的異常也與許多心腦血管疾病息息相關(guān)，因此采取有效的研究方法在早期發(fā)現(xiàn)異常對(duì)于指導(dǎo)臨床方案具有重要意義。

例如使用甲基化生物芯片尋找潛在的生物標(biāo)志物：首先樣本經(jīng)DNA甲基化修飾亞硫酸氫鹽處理，隨后進(jìn)行全基因組甲基化篩選，通過生物信息學(xué)對(duì)甲基化位點(diǎn)進(jìn)行分析并使用芯片點(diǎn)樣儀設(shè)計(jì)生物芯片找到潛在的生物靶點(diǎn)，采用Ion Torrent粒子流測(cè)序儀進(jìn)行單細(xì)胞甲基化測(cè)序，后期使用甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶聯(lián)合PCR評(píng)估甲基化水平，采用cfDNA樣本進(jìn)行結(jié)果驗(yàn)證。

多肽生物芯片尋找疾病相關(guān)靶點(diǎn)：首先對(duì)感興趣的靶點(diǎn)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，通過芯片點(diǎn)樣儀把多種篩選的靶點(diǎn)設(shè)計(jì)成多肽芯片，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行生信分析，經(jīng)過廣泛的生物信息學(xué)篩選的基因特異的探針與磁珠連接，組裝成bead array芯片通過雙色熒光染色檢測(cè)出標(biāo)記的核苷酸，結(jié)果采用ELISA實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

例如尋找與結(jié)腸癌相關(guān)的標(biāo)志物：使用健康和結(jié)腸癌患者的血清對(duì)16k（一張芯片上至少包含16000種人類蛋白）蛋白芯片進(jìn)行孵育，通過生物信息學(xué)分析和篩選找到疾病的相關(guān)靶點(diǎn)，使用芯片點(diǎn)樣儀將相關(guān)蛋白靶點(diǎn)設(shè)計(jì)成多肽芯片，孵育對(duì)照和患者血清進(jìn)行結(jié)果篩選，通過抗IgG熒光二抗進(jìn)行信號(hào)分析，結(jié)果使用bead array方法進(jìn)行結(jié)果驗(yàn)證。

該技術(shù)可應(yīng)用在過敏原篩查，自身免疫疾病，癌癥，感染疾病相關(guān)標(biāo)志物的尋找和發(fā)現(xiàn)等領(lǐng)域。
 

Part 3:
ArrayJet高通量芯片點(diǎn)樣儀在基于抗體的診斷技術(shù)中發(fā)揮通量高的特點(diǎn)，自身免疫抗體在腫瘤早期的無(wú)癥狀階段以及自身免疫疾病、神經(jīng)退行性疾病中存在明顯的表達(dá)差異，采用AIT蛋白芯片可以發(fā)現(xiàn)相關(guān)的抗原標(biāo)志物。
 

AIT蛋白芯片制備：15286個(gè)全長(zhǎng)人cDNA片段，使用His標(biāo)簽和鎳柱進(jìn)行純化富集，純化后在玻片進(jìn)行高密度點(diǎn)樣（32000個(gè)點(diǎn)/片），點(diǎn)樣體系（10-30ul/點(diǎn)）。后期檢測(cè)：孵育病人和正常人的血清，采用抗人的lgG熒光二抗進(jìn)行標(biāo)記，通過生物信號(hào)分析找到潛在的生物標(biāo)志物。

采用生物芯片技術(shù)進(jìn)行高通量篩選，對(duì)于尋找潛在抗原標(biāo)志物、醫(yī)藥研發(fā)、臨床診斷有重要意義。
 

在EP管中加入15ul血漿或血清，再加入500ul凝膠進(jìn)行離心，使用純化buffer清洗凝膠兩次，對(duì)血清采用純化buffer進(jìn)行稀釋，加入含有抗體的溶液，上下充分混合，離心收集富集的抗體，對(duì)樣品質(zhì)控150kD處含有均一的IgG抗體條帶，使用純化后的抗體對(duì)芯片進(jìn)行孵育篩選相關(guān)靶點(diǎn)。
 

病原體分泌蛋白對(duì)血清的反應(yīng)性對(duì)于明確感染類型，控制病情惡化十分必要。

病原體生物芯片研究方法：案例樣本來(lái)自于254種細(xì)菌菌株，其中臨床分離株 239種，乳酸桿菌 15種，除此之外還有黃曲霉菌3種，念球菌3種。使用芯片點(diǎn)樣儀將樣本點(diǎn)印在環(huán)氧樹脂包被的玻片上，孵育血漿，找到IgG抗體特異性菌株。
 

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