AVATAR在精準(zhǔn)模擬患者腫瘤微環(huán)境探尋腫瘤進(jìn)展背后機(jī)制的應(yīng)用
腫瘤微環(huán)境（TME）是指腫瘤在生長(zhǎng)過(guò)程中、與腫瘤的發(fā)生，發(fā)展和轉(zhuǎn)移密不可分的局部穩(wěn)態(tài)環(huán)境，它有幾個(gè)不同于正常組織的生理學(xué)特征，如腫瘤間質(zhì)液壓增高和缺氧。
圖1. 正常組織和腫瘤微環(huán)境的區(qū)別
腫瘤間質(zhì)液壓是決定腫瘤血供和營(yíng)養(yǎng)以及血液攜帶的治療劑釋放入腫瘤的重要參數(shù)，腫瘤間質(zhì)液壓增高會(huì)造成惡性腫瘤放療、化療、免疫治療困難。同樣，缺氧微環(huán)境對(duì)腫瘤細(xì)胞具有篩選作用，能夠使腫瘤的惡性程度進(jìn)一步提高，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物或放射治療不敏感，最終導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移和耐藥性。
因此，在體外模擬腫瘤微環(huán)境是一種研究腫瘤非常重要且必要的手段，它可以更好地指導(dǎo)臨床治療，實(shí)現(xiàn)癌癥的個(gè)性化精準(zhǔn)醫(yī)療。
AVATAR個(gè)體化細(xì)胞控制系統(tǒng)可以自由控制培養(yǎng)環(huán)境中的氧氣含量和壓力強(qiáng)度，在體外精準(zhǔn)模擬出加壓和缺氧的腫瘤微環(huán)境條件，使研究人員能夠在接近真實(shí)的環(huán)境中研究藥物作用機(jī)制、評(píng)估治療效果，得到更加科學(xué)的結(jié)果，同時(shí)也減少項(xiàng)目的優(yōu)化時(shí)間與成本費(fèi)用。
圖2. AVATAR個(gè)體化細(xì)胞控制系統(tǒng)
目前，AVATAR在世界范圍內(nèi)已有廣泛應(yīng)用，以下是AVATAR在前列腺癌細(xì)胞系耐藥性研究中的一個(gè)應(yīng)用案例。
探究前列腺癌細(xì)胞系的耐藥性
實(shí)驗(yàn)背景
恩雜魯胺（Enzalutamide）是一類(lèi)口服類(lèi)雄激素受體拮抗劑，已被美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于前列腺癌化療后進(jìn)展的轉(zhuǎn)移性去勢(shì)耐受前列腺癌的患者（即前列腺腫瘤或癌細(xì)胞隨經(jīng)化療但病灶仍然在生長(zhǎng)的患者）的治療，可延長(zhǎng)患者生存期。但遺憾的是在治療過(guò)程中幾乎所有患者都會(huì)產(chǎn)生耐藥性。
AR-V7的表達(dá)是對(duì)恩雜魯胺耐藥的生物標(biāo)志物之一。恩雜魯胺在人體中可以靶向作用于雄激素受體（AndrogenReceptor，AR）上的LBD結(jié)構(gòu)域，使雄激素不能與AR結(jié)合，阻斷AR信號(hào)通路，因此達(dá)到治療的效果。而AR-V7可以直接使恩雜魯胺無(wú)法與AR結(jié)合，導(dǎo)致前列腺癌患者對(duì)恩雜魯胺產(chǎn)生耐藥性。
為了確定前列腺癌細(xì)胞中對(duì)恩雜魯胺治療耐藥的機(jī)制，并生成篩選和評(píng)估化療藥物的模型，研究人員使用AVATAR系統(tǒng)模擬腫瘤組織微環(huán)境，使人前列腺癌細(xì)胞22Rv1和LNCaP在腫瘤間質(zhì)液壓增高和缺氧培養(yǎng)條件下（2 PSI+1%O2）培養(yǎng)，然后評(píng)估細(xì)胞生長(zhǎng)、基因表達(dá)譜和恩雜魯胺治療的藥物反應(yīng)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1. 腫瘤微環(huán)境條件下，人前列腺癌細(xì)胞對(duì)恩雜魯胺的耐藥性增強(qiáng)
圖3. 前列腺癌細(xì)胞在TME條件下誘導(dǎo)了對(duì)恩雜魯胺治療的耐藥性
人前列腺癌細(xì)胞22Rv1（A）和LNCaP（B）細(xì)胞在對(duì)照組（CO2培養(yǎng)箱）和實(shí)驗(yàn)組（腫瘤微環(huán)境條件：1%O2，0/2 PSI）培養(yǎng)兩個(gè)月，實(shí)驗(yàn)組中的癌細(xì)胞對(duì)恩雜魯胺產(chǎn)生耐藥性。
2. 腫瘤微環(huán)境條件誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞表達(dá)雄激素受體，尤其是AR-V7
圖4. 前列腺癌細(xì)胞在TME條件下AR-V7的表達(dá)情況
qPCR（A）和western blot（B）檢測(cè)腫瘤微環(huán)境條件下前列腺癌細(xì)胞22Rv1 中AR和AR-V7的表達(dá)，結(jié)果顯示，腫瘤微環(huán)境條件誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞表達(dá)雄激素受體，尤其是AR-V。圖4為三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表性結(jié)果*P＜0.05**P＜0.01。
3. 腫瘤微環(huán)境條件改變了前列腺癌細(xì)胞22Rv1和LNCaP的基因表達(dá)譜
圖5.腫瘤微環(huán)境條件下前列腺癌細(xì)胞22Rv1和LNCaP的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析
（A）22Rv1和LNCaP細(xì)胞在TME條件下基因表達(dá)顯著上調(diào)和顯著下調(diào)的基因數(shù)量。（B）22Rv1和LNCaP細(xì)胞在TME條件下基因表達(dá)上調(diào)和下調(diào)的維恩圖。（C）基因集富集分析（GSEA）繪制了22Rv1和LNCaP細(xì)胞缺氧、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和外源代謝的標(biāo)志性特征。（D）22Rv1和LNCaP細(xì)胞中顯著富集途徑的GSEA特征富集總譜。
4. 腫瘤微環(huán)境條件適應(yīng)的前列腺癌細(xì)胞中KDM3A表達(dá)的上調(diào)有助于AR-V7表達(dá)的增加
圖6. 腫瘤微環(huán)境上調(diào)22Rv1和LNCaP細(xì)胞中組蛋白去甲基化酶KDM3A的表達(dá)
前列腺癌細(xì)胞22Rv1（A）和LNCaP（B）中前20個(gè)差異表達(dá)基因的熱圖。qPCR結(jié)果證實(shí)，在TME條件下，22Rv1和LNCaP細(xì)胞中KDM3A的表達(dá)上調(diào)（C）。Western blot結(jié)果顯示，在TME條件下，HIF-1α和KDM3A蛋白水平增加（D）。KDM3A促進(jìn)AR-V7的選擇性剪接，導(dǎo)致在TME條件下AR-V8的更高水平，并誘導(dǎo)PSA蛋白表達(dá)。
5. 在腫瘤微環(huán)境條件培養(yǎng)的前列腺癌細(xì)胞系顯示波形蛋白表達(dá)增加
圖7. 腫瘤微環(huán)境誘導(dǎo)22Rv1和LNCaP細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）
將22Rv1和LNCaP細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境條件或標(biāo)準(zhǔn)CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，通過(guò)免疫熒光染色（A）、qPCR（B）和Western blot（C）分析上皮細(xì)胞標(biāo)記物E-鈣粘蛋白（CDH1）和間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物波形蛋白（VIM）的表達(dá)。結(jié)果表明，在腫瘤微環(huán)境條件下，22Rv1和LNCaP細(xì)胞中的間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物VIM上調(diào)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)論
作者比較了前列腺癌細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)、基因表達(dá)譜和對(duì)恩雜魯胺治療的藥物反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)適應(yīng)腫瘤微環(huán)境培養(yǎng)條件可以促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞系中AR-V7的表達(dá)，并有助于對(duì)恩雜魯胺的耐藥性。細(xì)胞系對(duì)腫瘤微環(huán)境培養(yǎng)條件的適應(yīng)可以為耐藥機(jī)制提供有意義的見(jiàn)解，同時(shí)為鑒定耐藥靶點(diǎn)和生物標(biāo)志物提供一種新的方法。
1.創(chuàng)造低氧高壓條件，模擬體內(nèi)微環(huán)境
自由控制氧氣含量和壓力強(qiáng)度，為所研究的細(xì)胞創(chuàng)造符合其在體內(nèi)的微環(huán)境。
2.縮小體外與體內(nèi)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果間的差異
模擬細(xì)胞在體內(nèi)的微環(huán)境，因此細(xì)胞的狀態(tài)也就更加真實(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)相當(dāng)。
3.有效精準(zhǔn)控制細(xì)胞狀態(tài)
除了可模擬體內(nèi)微環(huán)境外，更可借由參數(shù)的調(diào)整與優(yōu)化，控制細(xì)胞的狀態(tài)與命運(yùn)（如維持干細(xì)胞干性表征、定向誘導(dǎo)干細(xì)胞分化、提高基因編輯與轉(zhuǎn)染的效率等），相較傳統(tǒng)方式能更有效的提高反應(yīng)效果，不僅可縮短時(shí)效，更可減低實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所需成本花費(fèi)。
4.多通道且獨(dú)立的設(shè)計(jì)和便捷的可升級(jí)性
研究者可根據(jù)需求選擇多臺(tái)獨(dú)立腔體疊加放置，同時(shí)設(shè)置不同的環(huán)境條件。研究者可以橫跨不同的生理理狀態(tài)去評(píng)估細(xì)胞的基因與功能，或根據(jù)需求，采取多參數(shù)設(shè)置模式快速獲得更佳的生長(zhǎng)條件，大幅減少優(yōu)化時(shí)間與成本花費(fèi)。
5.空間占用小
可靈活地放置于任何常規(guī)環(huán)境，也可放置于特定空間，如超凈工作臺(tái)等，適合特殊應(yīng)用需求，如病毒或病原相關(guān)研究。
6. 顯著降低運(yùn)行成本
設(shè)備配置精密感應(yīng)器與氣體控制部件，因此可較傳統(tǒng)培養(yǎng)裝置降低≥90%的⽓體消耗。
圖1. 正常組織和腫瘤微環(huán)境的區(qū)別
腫瘤間質(zhì)液壓是決定腫瘤血供和營(yíng)養(yǎng)以及血液攜帶的治療劑釋放入腫瘤的重要參數(shù)，腫瘤間質(zhì)液壓增高會(huì)造成惡性腫瘤放療、化療、免疫治療困難。同樣，缺氧微環(huán)境對(duì)腫瘤細(xì)胞具有篩選作用，能夠使腫瘤的惡性程度進(jìn)一步提高，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物或放射治療不敏感，最終導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移和耐藥性。
因此，在體外模擬腫瘤微環(huán)境是一種研究腫瘤非常重要且必要的手段，它可以更好地指導(dǎo)臨床治療，實(shí)現(xiàn)癌癥的個(gè)性化精準(zhǔn)醫(yī)療。
AVATAR個(gè)體化細(xì)胞控制系統(tǒng)可以自由控制培養(yǎng)環(huán)境中的氧氣含量和壓力強(qiáng)度，在體外精準(zhǔn)模擬出加壓和缺氧的腫瘤微環(huán)境條件，使研究人員能夠在接近真實(shí)的環(huán)境中研究藥物作用機(jī)制、評(píng)估治療效果，得到更加科學(xué)的結(jié)果，同時(shí)也減少項(xiàng)目的優(yōu)化時(shí)間與成本費(fèi)用。
圖2. AVATAR個(gè)體化細(xì)胞控制系統(tǒng)
目前，AVATAR在世界范圍內(nèi)已有廣泛應(yīng)用，以下是AVATAR在前列腺癌細(xì)胞系耐藥性研究中的一個(gè)應(yīng)用案例。
探究前列腺癌細(xì)胞系的耐藥性
實(shí)驗(yàn)背景
恩雜魯胺（Enzalutamide）是一類(lèi)口服類(lèi)雄激素受體拮抗劑，已被美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于前列腺癌化療后進(jìn)展的轉(zhuǎn)移性去勢(shì)耐受前列腺癌的患者（即前列腺腫瘤或癌細(xì)胞隨經(jīng)化療但病灶仍然在生長(zhǎng)的患者）的治療，可延長(zhǎng)患者生存期。但遺憾的是在治療過(guò)程中幾乎所有患者都會(huì)產(chǎn)生耐藥性。
AR-V7的表達(dá)是對(duì)恩雜魯胺耐藥的生物標(biāo)志物之一。恩雜魯胺在人體中可以靶向作用于雄激素受體（AndrogenReceptor，AR）上的LBD結(jié)構(gòu)域，使雄激素不能與AR結(jié)合，阻斷AR信號(hào)通路，因此達(dá)到治療的效果。而AR-V7可以直接使恩雜魯胺無(wú)法與AR結(jié)合，導(dǎo)致前列腺癌患者對(duì)恩雜魯胺產(chǎn)生耐藥性。
為了確定前列腺癌細(xì)胞中對(duì)恩雜魯胺治療耐藥的機(jī)制，并生成篩選和評(píng)估化療藥物的模型，研究人員使用AVATAR系統(tǒng)模擬腫瘤組織微環(huán)境，使人前列腺癌細(xì)胞22Rv1和LNCaP在腫瘤間質(zhì)液壓增高和缺氧培養(yǎng)條件下（2 PSI+1%O2）培養(yǎng)，然后評(píng)估細(xì)胞生長(zhǎng)、基因表達(dá)譜和恩雜魯胺治療的藥物反應(yīng)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1. 腫瘤微環(huán)境條件下，人前列腺癌細(xì)胞對(duì)恩雜魯胺的耐藥性增強(qiáng)
圖3. 前列腺癌細(xì)胞在TME條件下誘導(dǎo)了對(duì)恩雜魯胺治療的耐藥性
人前列腺癌細(xì)胞22Rv1（A）和LNCaP（B）細(xì)胞在對(duì)照組（CO2培養(yǎng)箱）和實(shí)驗(yàn)組（腫瘤微環(huán)境條件：1%O2，0/2 PSI）培養(yǎng)兩個(gè)月，實(shí)驗(yàn)組中的癌細(xì)胞對(duì)恩雜魯胺產(chǎn)生耐藥性。
2. 腫瘤微環(huán)境條件誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞表達(dá)雄激素受體，尤其是AR-V7
圖4. 前列腺癌細(xì)胞在TME條件下AR-V7的表達(dá)情況
qPCR（A）和western blot（B）檢測(cè)腫瘤微環(huán)境條件下前列腺癌細(xì)胞22Rv1 中AR和AR-V7的表達(dá)，結(jié)果顯示，腫瘤微環(huán)境條件誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞表達(dá)雄激素受體，尤其是AR-V。圖4為三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表性結(jié)果*P＜0.05**P＜0.01。
3. 腫瘤微環(huán)境條件改變了前列腺癌細(xì)胞22Rv1和LNCaP的基因表達(dá)譜
圖5.腫瘤微環(huán)境條件下前列腺癌細(xì)胞22Rv1和LNCaP的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析
（A）22Rv1和LNCaP細(xì)胞在TME條件下基因表達(dá)顯著上調(diào)和顯著下調(diào)的基因數(shù)量。（B）22Rv1和LNCaP細(xì)胞在TME條件下基因表達(dá)上調(diào)和下調(diào)的維恩圖。（C）基因集富集分析（GSEA）繪制了22Rv1和LNCaP細(xì)胞缺氧、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和外源代謝的標(biāo)志性特征。（D）22Rv1和LNCaP細(xì)胞中顯著富集途徑的GSEA特征富集總譜。
4. 腫瘤微環(huán)境條件適應(yīng)的前列腺癌細(xì)胞中KDM3A表達(dá)的上調(diào)有助于AR-V7表達(dá)的增加
圖6. 腫瘤微環(huán)境上調(diào)22Rv1和LNCaP細(xì)胞中組蛋白去甲基化酶KDM3A的表達(dá)
前列腺癌細(xì)胞22Rv1（A）和LNCaP（B）中前20個(gè)差異表達(dá)基因的熱圖。qPCR結(jié)果證實(shí)，在TME條件下，22Rv1和LNCaP細(xì)胞中KDM3A的表達(dá)上調(diào)（C）。Western blot結(jié)果顯示，在TME條件下，HIF-1α和KDM3A蛋白水平增加（D）。KDM3A促進(jìn)AR-V7的選擇性剪接，導(dǎo)致在TME條件下AR-V8的更高水平，并誘導(dǎo)PSA蛋白表達(dá)。
5. 在腫瘤微環(huán)境條件培養(yǎng)的前列腺癌細(xì)胞系顯示波形蛋白表達(dá)增加
圖7. 腫瘤微環(huán)境誘導(dǎo)22Rv1和LNCaP細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）
將22Rv1和LNCaP細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境條件或標(biāo)準(zhǔn)CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，通過(guò)免疫熒光染色（A）、qPCR（B）和Western blot（C）分析上皮細(xì)胞標(biāo)記物E-鈣粘蛋白（CDH1）和間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物波形蛋白（VIM）的表達(dá)。結(jié)果表明，在腫瘤微環(huán)境條件下，22Rv1和LNCaP細(xì)胞中的間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物VIM上調(diào)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)論
作者比較了前列腺癌細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)、基因表達(dá)譜和對(duì)恩雜魯胺治療的藥物反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)適應(yīng)腫瘤微環(huán)境培養(yǎng)條件可以促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞系中AR-V7的表達(dá)，并有助于對(duì)恩雜魯胺的耐藥性。細(xì)胞系對(duì)腫瘤微環(huán)境培養(yǎng)條件的適應(yīng)可以為耐藥機(jī)制提供有意義的見(jiàn)解，同時(shí)為鑒定耐藥靶點(diǎn)和生物標(biāo)志物提供一種新的方法。
AVATAR 具體有哪些優(yōu)勢(shì)？
1.創(chuàng)造低氧高壓條件，模擬體內(nèi)微環(huán)境
自由控制氧氣含量和壓力強(qiáng)度，為所研究的細(xì)胞創(chuàng)造符合其在體內(nèi)的微環(huán)境。
2.縮小體外與體內(nèi)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果間的差異
模擬細(xì)胞在體內(nèi)的微環(huán)境，因此細(xì)胞的狀態(tài)也就更加真實(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)相當(dāng)。
3.有效精準(zhǔn)控制細(xì)胞狀態(tài)
除了可模擬體內(nèi)微環(huán)境外，更可借由參數(shù)的調(diào)整與優(yōu)化，控制細(xì)胞的狀態(tài)與命運(yùn)（如維持干細(xì)胞干性表征、定向誘導(dǎo)干細(xì)胞分化、提高基因編輯與轉(zhuǎn)染的效率等），相較傳統(tǒng)方式能更有效的提高反應(yīng)效果，不僅可縮短時(shí)效，更可減低實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所需成本花費(fèi)。
4.多通道且獨(dú)立的設(shè)計(jì)和便捷的可升級(jí)性
研究者可根據(jù)需求選擇多臺(tái)獨(dú)立腔體疊加放置，同時(shí)設(shè)置不同的環(huán)境條件。研究者可以橫跨不同的生理理狀態(tài)去評(píng)估細(xì)胞的基因與功能，或根據(jù)需求，采取多參數(shù)設(shè)置模式快速獲得更佳的生長(zhǎng)條件，大幅減少優(yōu)化時(shí)間與成本花費(fèi)。
5.空間占用小
可靈活地放置于任何常規(guī)環(huán)境，也可放置于特定空間，如超凈工作臺(tái)等，適合特殊應(yīng)用需求，如病毒或病原相關(guān)研究。
6. 顯著降低運(yùn)行成本
設(shè)備配置精密感應(yīng)器與氣體控制部件，因此可較傳統(tǒng)培養(yǎng)裝置降低≥90%的⽓體消耗。
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