晝夜節(jié)律是許多生物體的生物行為和生理功能的周期性更替。晝夜節(jié)律紊亂會影響宿主的神經(jīng)、代謝和免疫穩(wěn)態(tài)，從而導(dǎo)致一系列神經(jīng)退行性疾病、代謝疾病和癌癥。同樣的，腸道菌群也有自己的晝夜節(jié)律，小鼠的最新研究進(jìn)展表明，腸道菌群的豐度、位置和功能經(jīng)歷晝夜節(jié)律波動，這受食物攝入時間和飲食成分控制，并有可能影響胃腸道和其他器官的細(xì)菌抗原和代謝物。然而，腸道菌群的時鐘是否以及如何影響人類宿主的晝夜節(jié)律以及健康尚不清楚。來自中科院微生物所王軍等團(tuán)隊(duì)確定了人類和小鼠腸道菌群中具有相同的晝夜節(jié)律特征，并探究了其中的關(guān)鍵代謝物甲硫氨酸對宿主的影響，相關(guān)成果發(fā)表于Protein & Cell。

菌群測序和代謝組檢測

為了研究小鼠和人類腸道菌群中與節(jié)律相關(guān)的共同代謝特征，分別在早上10點(diǎn)鐘和晚上10點(diǎn)鐘收集10只小鼠糞便，進(jìn)行菌群測序和代謝組分析。菌群結(jié)果顯示，小鼠腸道菌群組成和功能表現(xiàn)出顯著晝夜差異（圖1A），夜間觀察到的腸道菌群豐富度和均勻度有升高趨勢（圖S1A和S1B））。還發(fā)現(xiàn)，具有顯著晝夜差異的標(biāo)志物種是膽型螺旋桿菌(Helicobacter bilis)，具有顯著晝夜差異的代謝通路有S-腺苷-L-甲硫氨酸循環(huán)通路I、甲基赤蘚糖醇磷酸通路I、L-賴氨酸生物合成III和硒氨基酸生物合成通路（圖1B）。結(jié)合作者最近的人的原位調(diào)查研究（該調(diào)查確定了具有晝夜節(jié)律振蕩的細(xì)菌分類群和代謝途徑），獲得了人和小鼠共有的兩條代謝通路，其中S-腺苷-L-甲硫氨酸循環(huán)通路I是唯一表現(xiàn)出相同模式的，即在白天活動的人類（白天）和夜間活動的小鼠（夜間）的清醒期，代謝活動增加，而在睡眠期則相反（圖1C）。

代謝組學(xué)分析結(jié)果顯示，小鼠在夜間（清醒期）共有24種糞便代謝物顯著增加，包括L-甲硫氨酸、消旋甲硫氨酸和甲硫氨酸亞砜（圖1D）。此外，8種代謝物顯示出減少的趨勢，例如N、N-二甲基鞘氨醇、N-甲基煙酰胺和鞘氨醇（圖1E和S1C）。通路富集分析確定了14條代謝通路，其中2條受到晝夜循環(huán)的顯著影響，其中甲硫氨酸代謝被列為最重要的通路（圖S1D）。

圖S1. 腸道菌群組成、功能和代謝物存在晝夜差異

甲硫氨酸處理上調(diào)時鐘基因表達(dá)

為了研究甲硫氨酸對宿主晝夜節(jié)律的潛在影響，用100μmol/L甲硫氨酸處理常用的腸屏障功能模型Caco2細(xì)胞24h，并檢測4個核心時鐘基因的細(xì)胞表達(dá)，即BMAL1、CLOCK、NR1D2（核受體亞家族1D組成員2）和PER2（圖1F）。mRNA結(jié)果顯示，甲硫氨酸處理后這些基因的表達(dá)顯著增加（圖1G）。鑒于甲硫氨酸可以作為S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)的前體作為膳食甲基供體，利用牛津納米孔測序技術(shù)(ONT)對Caco-2細(xì)胞進(jìn)行直接RNA測序(DRS)。然后，檢測mRNA N6-甲基腺苷(m6A)和5甲基胞嘧啶(5mC)修飾（圖1F），分別在對照載體和甲硫氨酸處理的Caco-2細(xì)胞中鑒定出1,572和3,302個顯著的m6A修飾位點(diǎn)，其中共有位點(diǎn)是471個，且在甲硫氨酸處理組中m6A修飾位點(diǎn)數(shù)量增加（圖1H）。在對照組和甲硫氨酸處理組中分別有69678和70317個5mC修飾位點(diǎn)，且共有位點(diǎn)是39307個（圖1I）。這些修飾位點(diǎn)用于計算轉(zhuǎn)錄本的m6A和5mC修飾率（MR），甲硫氨酸處理的細(xì)胞中MR增加（圖1H和1I）。

甲硫氨酸處理升高細(xì)胞甲基化水平

將轉(zhuǎn)錄本與基因比對，計算基因的MR，分別鑒定出900和2606個基因，且在甲硫氨酸處理組的細(xì)胞中m6A和5mC修飾水平增加。通過檢索GO數(shù)據(jù)庫，鑒定出m6A(29/900)和5mC(77/2606)水平增加的節(jié)律相關(guān)基因。且發(fā)現(xiàn)AHCY（腺苷高半胱氨酸酶）基因的m6A和5mC水平增加，已報道其蛋白質(zhì)產(chǎn)物對于周期性H3K4三甲基化和BMAL1向染色質(zhì)的募集至關(guān)重要并促進(jìn)隨后的晝夜節(jié)律轉(zhuǎn)錄活動。同樣，在甲硫氨酸處理的細(xì)胞中也觀察到AHCY的表達(dá)上調(diào)（圖1J）。總之，甲硫氨酸可以調(diào)節(jié)人體腸道細(xì)胞的時鐘基因表達(dá)，增加細(xì)胞整體甲基化，對整體節(jié)律相關(guān)基因產(chǎn)生重塑作用，其中增加的mRNA甲基化水平和AHCY基因mRNA的積累可能是一個機(jī)制。

甲硫氨酸處理降低細(xì)胞活性氧水平

據(jù)報道，晝夜節(jié)律紊亂（睡眠剝奪；SD）的另一個重要后果是腸道活性氧（ROS）的積累，這是一種導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷和壞死的有害物質(zhì)。也有報道指出，腸道菌群可能會調(diào)節(jié)SD誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和認(rèn)知障礙。鑒于甲硫氨酸是一種還原性氨基酸，隨后研究了它對ROS的影響。與對照組相比，在甲硫氨酸處理的Caco-2細(xì)胞中檢測到ROS水平顯著降低（圖1K）。然而，對于三種抗氧化酶，包括超氧化物歧化酶1(SOD1)、超氧化物歧化酶1(SOD2)和過氧化氫酶，western結(jié)果顯示，甲硫氨酸并未顯著增加它們的細(xì)胞內(nèi)水平（圖1L）。因此，甲硫氨酸可作為直接抗氧化劑降低細(xì)胞活性氧。

圖1. 具有晝夜波動識別的關(guān)鍵腸道菌群代謝物及其對 Caco-2 細(xì)胞的影響

補(bǔ)充甲硫氨酸降低SD小鼠的血清皮質(zhì)酮水平

接下來，在睡眠剝奪(SD)小鼠模型中測試了甲硫氨酸的抗氧化活性。設(shè)置四個分組：一組具有正常飲食和睡眠-覺醒周期（正常）的對照組，以及三組不同飲食甲硫氨酸處理（0%、0.86%、1.36%，分別對應(yīng)：0，中和高M(jìn)et）的SD組，在限制室中進(jìn)行三天的SD干預(yù)（圖2A）。結(jié)果顯示，盡管飲食攝入量增加，但體重顯著下降，特別是對于無Met的SD組（圖2B）。此外，血清皮質(zhì)酮，一種已知的晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)劑，在SD組中顯著增加，而甲硫氨酸補(bǔ)充劑降低了血清皮質(zhì)酮循環(huán)水平，表明甲硫氨酸具有逆轉(zhuǎn)SD誘導(dǎo)的皮質(zhì)酮增加的潛力（圖2D）。

補(bǔ)充甲硫氨酸降低SD小鼠腸道ROS水平

通過二氫乙錠(DHE)染色分析腸道ROS水平，結(jié)果顯示，與正常組相比，中等Met的SD組的小鼠腸道ROS水平顯著增加，與之前的報告一致。此外，SD干預(yù)后，不同甲硫氨酸水平對腸道ROS水平影響不同，其中富含Met組的ROS顯著降低，而喂食無Met食物的小鼠的ROS水平增加（圖2C）。此外，分別檢測腸道、肝臟和大腦的H2O2水平，結(jié)果表明，在除了大腦之外的受檢組織中，膳食甲硫氨酸的作用模式與小腸中ROS的作用模式相似（圖2E）。因此，甲硫氨酸無論在體外還是體內(nèi)都可以作為一種強(qiáng)大的抗氧化化合物。

補(bǔ)充甲硫氨酸降低SD小鼠炎癥相關(guān)基因表達(dá)

鑒于SD報告的其他有害影響，隨后研究了甲硫氨酸的影響。在小鼠小腸、肝臟和血細(xì)胞中進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序。結(jié)果顯示，與正常組相比，SD組腸道中等Met的一些晝夜節(jié)律基因的表達(dá)增加，包括Per2、Per3和Dbp（D-box結(jié)合PARbZIP轉(zhuǎn)錄因子）。通路富集分析表明，SD小鼠的小腸中與晝夜節(jié)律相關(guān)的生物學(xué)過程上調(diào)（圖2F）。膳食甲硫氨酸限制則導(dǎo)致SD小鼠中與血管舒張相關(guān)的基因表達(dá)增加，而甲基化的相關(guān)基因減少。此外，在循環(huán)血細(xì)胞中，無Met的SD組（腸道中ROS水平最高）的炎癥信號顯著增加，如細(xì)胞對粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞的反應(yīng)、趨化因子生物合成過程和細(xì)胞因子生物合成過程。同時，補(bǔ)充甲硫氨酸會下調(diào)這些組織中與黏膜免疫反應(yīng)和先天免疫反應(yīng)等功能相關(guān)的基因，這表明甲硫氨酸可能會減少SD誘導(dǎo)的全身炎癥，與ROS的中和作用可能是相關(guān)的。

補(bǔ)充甲硫氨酸改善SD小鼠腸道菌群失調(diào)

此外，宏基因組分析表明SD誘導(dǎo)的腸道菌群失調(diào)，與之前的報告一致，其組成和功能顯著改變，包括一些有益菌，如假長雙歧桿菌的豐度顯著降低；有害菌，如甲型流感病毒和Dorea spp增加。此外，潛在有害菌，如鼠乳桿菌（據(jù)報道與腸道生態(tài)失調(diào)和生物素缺乏有關(guān)），以及幾種已知的病原體包括鼠骨肉瘤病毒、小鼠乳腺腫瘤病毒和肺炎支原體，在無Met的SD組中顯著富集（圖2G和2H）。然而，這些菌隨著甲硫氨酸的補(bǔ)充而減少。而有益菌（如狄氏副擬桿菌 Parabacteroides distasonis，據(jù)報道可改善肥胖和代謝功能障礙），以及Oscillibactersp.1_3的相對豐度，隨著甲硫氨酸的補(bǔ)充而顯著增加（圖2H)。同時，腸道菌群的代謝活動也顯示出各組之間的顯著變化。總之，甲硫氨酸具有保護(hù)或恢復(fù)腸道菌群免受SD引起的生態(tài)失調(diào)的額外潛力。

圖2. 甲硫氨酸對睡眠剝奪小鼠模型的保護(hù)作用

小結(jié)

本研究從人和小鼠共有的代謝通路和具有小鼠和人類晝夜模式的代謝物中確定了關(guān)鍵的腸道菌群代謝物甲硫氨酸，且發(fā)現(xiàn)甲硫氨酸代謝是小鼠體內(nèi)受晝夜循環(huán)影響最大的菌群功能；補(bǔ)充甲硫氨酸可顯著增加Caco-2細(xì)胞中晝夜節(jié)律基因的表達(dá)。從機(jī)制上講，補(bǔ)充甲硫氨酸增加了整體甲基化水平，以及一個至關(guān)重要的特定基因AHCY水平。隨后通過膳食甲硫氨酸處理探究SD小鼠模型中甲硫氨酸的作用，揭示了它具有中和SD誘導(dǎo)的ROS并減輕與SD相關(guān)的炎癥和腸道菌群失調(diào)的多重影響，在治療常見的睡眠剝奪和隨之而來的不良反應(yīng)方面具有很高的藥物應(yīng)用潛力。

參考文獻(xiàn)

Gut microbial methionine impacts circadian clock gene expression and reactive oxygen species level in host gastrointestinal tract. Protein&Cell. 2022.

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本研究通過糞便代謝組學(xué)以及通路分析聚焦到關(guān)鍵的腸道菌群代謝相關(guān)的甲硫氨酸通路及其調(diào)控的病理生理作用。糞便（腸內(nèi)容物）中微生物-宿主共生代謝物含量豐富，已被證明與多種疾病的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。麥特繪譜擁有業(yè)內(nèi)強(qiáng)大的Q600全定量代謝組、Q300全定量代謝組、Q200宏代謝組以及菌群相關(guān)的16S rDNA測序和宏基因組等方法，適用于包括糞便（腸內(nèi)容物）樣本在內(nèi)的多種生物樣本分析，并提供代謝組學(xué)一站式整體解決方案，獨(dú)家的檢測技術(shù)、全面的數(shù)據(jù)報告以及專業(yè)的售后探討，助力您的科研探索之路不斷創(chuàng)新和突破。詳情歡迎咨詢麥特繪譜熱線400-867-2686，獲取詳細(xì)資料！