細(xì)胞培養(yǎng)中預(yù)防細(xì)胞老化操作方法
細(xì)胞老化的概念
生物個體及其細(xì)胞需經(jīng)生長、發(fā)育、老化及死亡等階段，老化是生命發(fā)展的必然，任何細(xì)胞從誕生之時起，老化過程就開始了。老化的細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白、酶蛋白和受體蛋白合成減少，攝取營養(yǎng)和修復(fù)染色體損傷的能力均下降，表現(xiàn)為細(xì)胞和胞核變形，線粒體、高爾基體扭曲或呈囊泡狀，胞質(zhì)色素沉著，細(xì)胞體積縮小，由此導(dǎo)致器官重量減輕，間質(zhì)增生硬化，功能代謝降低，儲備功能不足。遺傳程序?qū)W說：
遺傳程序?qū)W說（genetic programmed theory）：認(rèn)為細(xì)胞的老化是由遺傳因素決定的，最終的老化死亡是遺傳信息耗竭的結(jié)果。例如體外培養(yǎng)的人成纖維細(xì)胞經(jīng)過50次分裂后便自行停止分裂；同卵雙生子“同生共死”現(xiàn)象等，都支持此學(xué)說。現(xiàn)已了解，控制細(xì)胞分裂次數(shù)的機(jī)制與細(xì)胞內(nèi)染色體末端的端粒結(jié)構(gòu)有關(guān)。
細(xì)胞老化的基本特征
1. 細(xì)胞老化最開始的現(xiàn)象通常為細(xì)胞內(nèi)部會出現(xiàn)空泡（可能是凋亡小體），也可能會出現(xiàn)黑點(diǎn)，大多沿細(xì)胞周邊排布，內(nèi)部中間也可能會顯現(xiàn)一些，但相對周邊為少。
3. 細(xì)胞折光性變差，鏡下可見細(xì)胞“變薄”，做轉(zhuǎn)染實(shí)驗時，細(xì)胞死亡率會較高。但培養(yǎng)液不會發(fā)生迅速變黃的現(xiàn)象，仍清亮。（但如果是細(xì)菌污染的話，一般會出現(xiàn)培養(yǎng)液的迅速變黃，混濁，鏡下可見大量繁殖的細(xì)菌；若是支原體污染的話，細(xì)胞也會失去正常形態(tài)，會有細(xì)胞的死亡）。
4. 細(xì)胞的貼壁性減弱，開始有細(xì)胞漂浮于培養(yǎng)液中。
5. 老化的細(xì)胞，表面分泌物會增多，細(xì)胞表面的純凈度越來越低。
6. 分裂的細(xì)胞數(shù)量明顯地減少同時細(xì)胞的增殖速度也會大大下降。
7. 細(xì)胞開始長角分化。
細(xì)胞形態(tài)改變
雖然由于細(xì)胞周期的中斷和DNA復(fù)制的停止，老化細(xì)胞內(nèi)的DNA含量與正常細(xì)胞類似，但 RNA與蛋白質(zhì)豐度均比正常細(xì)胞要明顯升高。這是因為，盡管細(xì)胞進(jìn)入老化階段后蛋白質(zhì)的整體合成速率降低，但是蛋白質(zhì)的降解體系受到更加明顯的抑制，導(dǎo)致蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)持續(xù)堆積。但，由于不同組織來源的細(xì)胞，其形態(tài)本就各不相同，因此，目前還并無客觀的、統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)從細(xì)胞形態(tài)判斷并定義老化細(xì)胞。換句話說，目前并不能直接根據(jù)細(xì)胞的形態(tài)去判斷是否老化細(xì)胞。
無論是原代細(xì)胞或是細(xì)胞株，在細(xì)胞培養(yǎng)過程中細(xì)胞老化現(xiàn)象是存在且常見的，但卻容易被操作人員忽略，老化的細(xì)胞會出現(xiàn)的特征包括：細(xì)胞增殖變慢、細(xì)胞核體積異常及多核（4-8核）、表面分泌物增多、細(xì)胞體積增大、細(xì)胞扁平、細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡等現(xiàn)象。
細(xì)胞老化原因總結(jié)
1. 細(xì)胞老化最開始的現(xiàn)象通常為細(xì)胞內(nèi)部會出現(xiàn)空泡（可能是凋亡小體），也可能會出現(xiàn)黑點(diǎn)，大多沿細(xì)胞周邊排布，內(nèi)部中間也可能會顯現(xiàn)一些，但相對周邊較少；
3. 老化以后的細(xì)胞會出現(xiàn)立體感慢慢消失，開始成扁平狀，細(xì)胞與細(xì)胞之間的間隔減小或混在一起，細(xì)胞不再是梭形，而會成為各種不規(guī)則形狀；
4. 細(xì)胞折光性變差，鏡下可見細(xì)胞“變薄”，做轉(zhuǎn)染實(shí)驗時，細(xì)胞死亡率會較高，但培養(yǎng)液不會發(fā)生迅速變黃的現(xiàn)象，仍清亮。（如果是細(xì)菌污染的話，一般會出現(xiàn)培養(yǎng)液的迅速變黃，混濁，鏡下可見大量繁殖的細(xì)菌；若是支原體污染的話，細(xì)胞也會失去正常形態(tài)，會有細(xì)胞的死亡）；
5. 細(xì)胞的貼壁性減弱，開始有細(xì)胞漂浮在培養(yǎng)液中；
6. 老化的細(xì)胞表面分泌物會增多，細(xì)胞表面的純凈度越來越低；
7. 分裂的細(xì)胞數(shù)量明顯的減少，同時細(xì)胞的增殖速度也會大大下降；
8. 細(xì)胞開始長角分化。
細(xì)胞培養(yǎng)中如何預(yù)防老化
1. 防止細(xì)胞老化最主要還是要做到勤觀察、勤換液、勤傳代、勤保種，特別是傳代，不能等細(xì)胞太密了之后傳，一般細(xì)胞建議長到70％融合度傳代最好；
2. 換培養(yǎng)液應(yīng)該根據(jù)自己細(xì)胞消耗培養(yǎng)基的情況來確定是否該換。如果感覺時間不好把握的話就多培養(yǎng)幾瓶細(xì)胞，在不同的時間換液，最后再來比較下，看什么時候換液好，得出自己的結(jié)論；
4. 在間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)時必然要進(jìn)行消化，但是消化對細(xì)胞的表面蛋白質(zhì)有很強(qiáng)的破壞作用，因此不能長時間進(jìn)行消化并且在選擇消化酶時也要選擇較為合適的pH和濃度，不然就會使細(xì)胞老化或者分化；
5. 在開始養(yǎng)細(xì)胞并傳代時，也要特別注意凍存細(xì)胞，以保持細(xì)胞有種子庫存在，可以有效避免細(xì)胞損傷。
雖然，老化細(xì)胞不會立即死亡，但其基因表達(dá)會發(fā)生變化，如果細(xì)胞老化現(xiàn)象嚴(yán)重，建議從種子庫或工作庫重新復(fù)蘇細(xì)胞。
