文章摘要

全實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)化（TLA）臨床標(biāo)本的處理

培養(yǎng)基平板的培養(yǎng)和成像

培養(yǎng)基平板的檢驗(yàn)

實(shí)施和應(yīng)用

減少臨床樣本周轉(zhuǎn)時(shí)間
通過(guò)紙片擴(kuò)散試驗(yàn)實(shí)現(xiàn)檢測(cè)自動(dòng)化
厭氧菌和多重耐藥的革蘭氏陰性菌常規(guī)AST
結(jié)論

前言提要

19世紀(jì)早期發(fā)展起來(lái)的自動(dòng)化工業(yè)一方面是為了提高生產(chǎn)性能，降低成本，另一方面是為了工人的安全利益考慮。信息技術(shù)使自動(dòng)化得到快速發(fā)展，自動(dòng)化能夠減輕人們繁瑣的體力勞動(dòng)和重復(fù)性勞動(dòng)，還能夠給企業(yè)在不增加員工的情況下提高了生產(chǎn)率，同時(shí)企業(yè)降低了運(yùn)營(yíng)成本，提高了產(chǎn)品利用率，提高了生產(chǎn)效率，操作還具有可靠性。大家雖然認(rèn)識(shí)到自動(dòng)化有許多好處，但自動(dòng)化也面臨諸多現(xiàn)實(shí)問(wèn)題。目前自動(dòng)化幾乎在所有的行業(yè)中都得到了有效實(shí)施應(yīng)用，包括醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室。
 

01全實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)化臨床標(biāo)本的處理

TLA（Total Lab Automation）可以提高效率和樣本可追溯性。實(shí)驗(yàn)室收到樣本后，立即對(duì)所有樣本進(jìn)行連續(xù)處理。根據(jù)樣本類型和要求的分析，自動(dòng)選擇并標(biāo)記適用的培養(yǎng)基。根據(jù)劃線模式，利用標(biāo)定后的接種環(huán)對(duì)樣本進(jìn)行接種。接種的培養(yǎng)基通過(guò)傳送帶迅速轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中。這允許跳過(guò)樣本的批處理以及手動(dòng)工作列表的創(chuàng)建。TLA還通過(guò)大幅減少標(biāo)本的處理來(lái)提高技術(shù)人員的安全水平，因?yàn)榕囵B(yǎng)皿的檢查是通過(guò)數(shù)字圖像在屏幕上進(jìn)行的。

02培養(yǎng)基平板的培養(yǎng)和成像

通過(guò)使用TLA，接種的培養(yǎng)基可以及時(shí)地從處理區(qū)轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱。瓊脂平板在最佳生長(zhǎng)條件、穩(wěn)定的溫度和適宜的環(huán)境下培養(yǎng)，因?yàn)榕囵B(yǎng)箱的門在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中始終保持關(guān)閉。微生物生長(zhǎng)通過(guò)在預(yù)定時(shí)間點(diǎn)拍攝的高分辨率數(shù)字圖像進(jìn)行監(jiān)測(cè)。這使得能夠更快速地檢測(cè)微生物生長(zhǎng)，同時(shí)也提高了緩慢生長(zhǎng)病原體的復(fù)壯。此外，TLA使用一種軟件，可以在更高的放大率下查看數(shù)字圖像，從而促進(jìn)對(duì)菌落形態(tài)的進(jìn)一步判斷和混合培養(yǎng)物的檢測(cè)。數(shù)字圖像由訓(xùn)練有素的技術(shù)人員進(jìn)行解讀，與傳統(tǒng)的診斷工作相比，情況完全不同，因?yàn)榧?xì)菌菌落在屏幕上呈現(xiàn)形態(tài)和手工操作判斷非常不同。TLA最終建立了一個(gè)圖像庫(kù)，可以用于對(duì)比校對(duì)，也可以在與傳染病專家討論時(shí)提供幫助并對(duì)個(gè)別患者進(jìn)行分析。

03培養(yǎng)基平板的檢驗(yàn)

為了最大限度地利用成像，應(yīng)在不同的時(shí)間點(diǎn)拍攝數(shù)字圖像，同時(shí)觀察最早出現(xiàn)的微生物，以便盡早檢測(cè)較早出現(xiàn)的微生物生長(zhǎng)情況（Figure1）。因此，與常規(guī)檢查相比，病原體的鑒定和抗生素耐藥性檢測(cè)（AST）可以更早地獲得，因此縮短了周轉(zhuǎn)時(shí)間（TAT）。

使用TLA，將每個(gè)接種的培養(yǎng)皿培養(yǎng)一段時(shí)間，以便在白天和晚上都可以進(jìn)行處理。這種處理效率最高，對(duì)TAT產(chǎn)生了有益的影響，可以更好地管理工作任務(wù)和工作流程。（Figure 2）
 

使用數(shù)字圖像對(duì)培養(yǎng)基平板進(jìn)行評(píng)估判斷和解讀仍由實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員執(zhí)行，他們確定需要分離哪些目標(biāo)菌落，并對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步處理，以進(jìn)行鑒定和AST。當(dāng)前版本的TLA無(wú)法取代這些人工操作。然而，市場(chǎng)上新推出的其他自動(dòng)化系統(tǒng)（例如Copan Colibri™), 可以通過(guò)MALDI-TOF和標(biāo)準(zhǔn)化接種物制備目標(biāo)微生物鑒定（ID）以及AST（Figure 3）。ID和AST結(jié)果也必須由熟練的技術(shù)人員進(jìn)行解讀，這需要在人員配備方面進(jìn)行充分考慮。為了匹配實(shí)驗(yàn)室工作量與診斷活動(dòng)水平，TLA允許在任何時(shí)候跟蹤整個(gè)診斷路徑中的所有樣本。TLA還提供了評(píng)估流程和團(tuán)隊(duì)效率的不同指標(biāo)，以及對(duì)患者檢測(cè)結(jié)果的其他解讀，包括抗生素耐藥性的趨勢(shì)分析。
 

04實(shí)施和應(yīng)用

臨床微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室如今面臨著許多不同的挑戰(zhàn)，包括需要：（1）提高效率（即提供更具成本效益的診斷）；（2）提供早期結(jié)果（即縮短TAT）；（3）遵守要求越來(lái)越高的認(rèn)證要求（即提供可追溯性和文件，以評(píng)估整個(gè)診斷過(guò)程的質(zhì)量）；（4）應(yīng)對(duì)越來(lái)越多的耐多藥生物帶來(lái)的挑戰(zhàn)（即快速提供更全面的AST，但在需要時(shí)）。大多數(shù)這樣的挑戰(zhàn)都可以通過(guò)TLA得到顯著解決。然而，TLA的成功實(shí)施需要：（1）傳統(tǒng)工作流程的重大變化；（2）強(qiáng)大的領(lǐng)導(dǎo)技能，以及項(xiàng)目所有合作者的團(tuán)隊(duì)合作；（3）在整個(gè)實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)型期內(nèi)技術(shù)人員的個(gè)性化支持。
 

05減少臨床樣本周轉(zhuǎn)時(shí)間

在過(guò)去20年中，醫(yī)療行業(yè)投入了大量資源來(lái)開(kāi)發(fā)準(zhǔn)確和快速的檢測(cè)方法，以減少臨床醫(yī)學(xué)中的樣本周轉(zhuǎn)時(shí)間（TAT）。隨著抗生素耐藥性的不斷增加，需要快速地給出應(yīng)對(duì)策略，以便對(duì)患者能夠及時(shí)治療。在全實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)化（TLA）出現(xiàn)之前，主要用基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）鑒定細(xì)菌、分枝桿菌、酵母和霉菌，目前該方法取代了常規(guī)的生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方法。與用于微生物鑒定的常規(guī)方法或分子水平分析相比，MALDI-TOF-MS具有以下三個(gè)優(yōu)點(diǎn)：（1）周轉(zhuǎn)時(shí)間快（2）樣本量要求低（3）試劑成本適中。使用MALDI-TOF-MS能夠準(zhǔn)確、快速地鑒定微生物，有助于快速提供治療方案，特別是意外感染了病原體時(shí)，該方法特別有效。因此，這項(xiàng)技術(shù)使抗菌治療、感染預(yù)防和控制措施能夠得到有效的實(shí)施（Figure 4A/B）。
 

06紙片擴(kuò)散試驗(yàn)實(shí)現(xiàn)檢測(cè)自動(dòng)化

全實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)化（TLA）在許多領(lǐng)域得到推廣應(yīng)用，抗生素耐藥性檢測(cè)全自動(dòng)化解決方案的實(shí)施，是全實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)化成功案例之一。在一項(xiàng)研究中，Copan為自動(dòng)紙片擴(kuò)散AST開(kāi)發(fā)了一種新模塊，包括一個(gè)可容納50個(gè)抗生素藥筒的轉(zhuǎn)盤。開(kāi)發(fā)這個(gè)新模塊的明確目標(biāo)是，通過(guò)增加第二條傳送帶，最大限度地減少AST線上的工作流程瓶頸。這個(gè)新的全集成自動(dòng)化系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)：可以使用至少四個(gè)不同的菌落制備接種懸浮液，以篩選不同的抗性模式；在特定平板的整個(gè)表面上自動(dòng)接種細(xì)菌細(xì)胞懸浮液；根據(jù)預(yù)設(shè)置的面板分配抗生素盤；將培養(yǎng)基運(yùn)輸至培養(yǎng)箱；在設(shè)置的時(shí)間點(diǎn)獲取平板的高質(zhì)量數(shù)字化圖像；最后獲得并解讀所有受試抗生素的抑制圈直徑大小。
 

通過(guò)紙片擴(kuò)散來(lái)評(píng)估AST全自動(dòng)解決方案的準(zhǔn)確性時(shí)，需要遵循的基本規(guī)則可以總結(jié)為兩點(diǎn)：（1）評(píng)估這種新方法檢測(cè)最重要的耐藥機(jī)制，應(yīng)包括具有代表性的非重復(fù)臨床菌株數(shù)量，以及這些菌株對(duì)不同類別的抗生素表現(xiàn)出耐藥模式；（2）為了計(jì)算耐藥的百分比誤差，分析中還應(yīng)包括大量非重復(fù)敏感臨床菌株。
 

07革蘭氏陰性菌常規(guī)AST

在過(guò)去十年中，研究表明，厭氧菌中抗生素耐藥性穩(wěn)步增加了。面對(duì)這樣的現(xiàn)狀，對(duì)厭氧菌進(jìn)行常規(guī)耐藥性試驗(yàn)十分必要。作為全自動(dòng)紙片擴(kuò)散的補(bǔ)充，通過(guò)與目前的常規(guī)方法ATB ANA®測(cè)試法（BioMérieux）進(jìn)行比較，在大量臨床相關(guān)厭氧菌株上測(cè)試了Thermo Scientific™ Sensititre™ 厭氧菌MIC平板的準(zhǔn)確性，兩種方法之間的一致性達(dá)到95%。通過(guò)整合靶向治療中使用的最新分子，為多重抗性革蘭氏陰性菌設(shè)計(jì)了一種新的平板。該平板由Thermo Scientific™制造并使用ATCC參考菌株進(jìn)行驗(yàn)證。目前只要AST紙片擴(kuò)散檢測(cè)到設(shè)定的抗性模式，這個(gè)平板就可以進(jìn)行下一步測(cè)試。正如自動(dòng)AST測(cè)試所研究的那樣，這一設(shè)計(jì)能夠通過(guò)系統(tǒng)地針對(duì)可疑菌株，以合理的成本有效監(jiān)測(cè)抗生素耐藥性。
 

Sensitre®敏感性系統(tǒng)采用一種固體平板設(shè)計(jì)方法。該方法可以測(cè)試定性（敏感或耐藥）和定量最小抑制濃度（MIC）試驗(yàn)。人工制備菌株懸浮液，并使用Sensitre Autoinvocator®/AIM®自動(dòng)接種平板。固體平板上添加了為測(cè)試的微生物選擇的連續(xù)稀釋的抗菌劑。接種培養(yǎng)后，使用Sensitire®手動(dòng)查看器讀取結(jié)果。通過(guò)渾濁或底部細(xì)胞沉積來(lái)測(cè)試細(xì)菌生長(zhǎng)情況。最小抑制濃度（MIC）是指抑菌試驗(yàn)中可見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度。

在過(guò)去的幾十年里，多重耐藥的革蘭氏陰性細(xì)菌感染已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)和全球衛(wèi)生領(lǐng)域關(guān)注的主要領(lǐng)域之一。為了優(yōu)化治療方案，并應(yīng)對(duì)不斷增加的產(chǎn)碳青霉烯酶的革蘭氏陰性細(xì)菌，使用最有效藥物的添加使用最小抑制濃度（MIC）已變得至關(guān)重要。通過(guò)對(duì)多重耐藥（MDR）菌株進(jìn)行靶向AST測(cè)定，同時(shí)結(jié)合治療藥物監(jiān)測(cè)（TDM），可以得到最有效的治療方法。由于瓊脂擴(kuò)散不能提供MIC，如在培養(yǎng)MDR菌株或厭氧菌時(shí)，Sensititre®是對(duì)全自動(dòng)AST紙片擴(kuò)散的補(bǔ)充。

08結(jié)論

全實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)化（TLA）現(xiàn)已被證明能夠有效進(jìn)行臨床微生物學(xué)檢測(cè)，可以克服微生物實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)檢測(cè)所面臨的多樣性和復(fù)雜性。能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)各種指標(biāo)（臨床應(yīng)用、檢測(cè)效率、可追溯性、質(zhì)量管理和TAT）進(jìn)行監(jiān)測(cè)，通過(guò)紙片擴(kuò)散能夠?qū)崿F(xiàn)AST的完全自動(dòng)化。
 

人工智能（AI）的實(shí)施不僅可以快速識(shí)別細(xì)菌生長(zhǎng)（檢測(cè)），還可以區(qū)分細(xì)菌形態(tài)（分割）和統(tǒng)計(jì)相應(yīng)的菌落（計(jì)數(shù)），這將進(jìn)一步增強(qiáng)微生物檢測(cè)工作流程，并能夠確保試驗(yàn)的可重復(fù)和可預(yù)測(cè)�，F(xiàn)在需要進(jìn)行仔細(xì)的驗(yàn)證研究，以便使用人工智能自動(dòng)處理陰性培養(yǎng)物，并在無(wú)需人工干預(yù)的情況下自動(dòng)獲取試驗(yàn)結(jié)果。

 

信息來(lái)源：Cherkaoui A, Schrenzel J. Total Laboratory Automation for Rapid Detection and Identification of Microorganisms and Their Antimicrobial Resistance Profiles. Front Cell Infect Microbiol. 2022 Feb 3;12:807668. doi: 10.3389/fcimb.2022.807668.

文獻(xiàn)來(lái)源 | 本文由中科院上海生命科學(xué)信息中心與上海曼森生物合作供稿

內(nèi)容審核 | 曼森生物郝玉有

排版編輯 | 曼森生物劉娟娟

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