​使用微波增強(qiáng)的多肽固相合成（SPPS）可以快速制備具有良好純度的環(huán)狀二硫鍵多肽（Cyclic disulfide-bridged peptides）。肽激素催產(chǎn)素（Oxytocin）1的合成在3小時(shí)內(nèi)完成，純度為69%。BMP受體激活素樣激酶3(BMP receptor activin-like kinase 3，Alk3) 肽激動(dòng)劑THR-1232的制備在3小時(shí)內(nèi)完成，純度為77%。CHEC-73是一種淀粉樣蛋白生成的神經(jīng)保護(hù)肽抑制劑，可在3小時(shí)內(nèi)制備，純度為80%。最后，在4小時(shí)內(nèi)合成了一種來(lái)自錐螺的肽毒素(conotoxin-SI)4，其含有兩個(gè)二硫鍵，純度67%。

 

簡(jiǎn)介

含有二硫鍵的環(huán)狀肽是一類(lèi)具有廣泛生物學(xué)功能的化合物，包括從毒液到不可或缺的激素⁵。二硫鍵有助于穩(wěn)定肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)和構(gòu)象，提高蛋白水解穩(wěn)定性和靶標(biāo)親和力⁶。因?yàn)槠渚哂袕V闊的治療潛力，人們對(duì)合成環(huán)狀二硫鍵橋肽的興趣穩(wěn)步增長(zhǎng)。

通過(guò)使用正交保護(hù)的半胱氨酸氨基酸，例如Fmoc-(S)-Cys(Mmt)- OH和Fmoc-(S)-Cys(STmp)-OH，SPPS可以制備具有二硫鍵的肽（圖1）。Cys(Mmt)基團(tuán)可以使用三氟乙酸(TFA)的稀溶液選擇性脫保護(hù)，而Cys(STmp) 基團(tuán)使用二硫蘇糖醇(DTT)作為還原劑進(jìn)行正交脫保護(hù)。去保護(hù)后，可以使用N-氯代琥珀酰亞胺(NCS)作為溫和氧化劑，選擇性氧化半胱氨酸硫醇基團(tuán)以形成二硫鍵⁷。將微波能量應(yīng)用于二硫橋肽的合成可以實(shí)現(xiàn)更有效的偶聯(lián)，從而節(jié)約合成時(shí)間和提高純度(CarboMAXTM)⁸。

圖1 左：Fmoc-(S)-Cys(Mmt)-OH；

右：Fmoc-(S)-Cys(STmp)-OH

 

材料和方法

試劑

以下含有指定的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)Fmoc氨基酸購(gòu)自CEM Corporation (Matthews, NC) ：Ala、Arg (Pbf)、Asn (Trt)、Asp (OMpe)、Gln (Trt)、Gly、Ile、Leu、Lys (Boc)、Phe、Pro、Ser (tBu)、Tyr(tBu) 和Val。Rink Amide ProTideTM LL樹(shù) 脂 和Cl-MPA ProTideTM LL樹(shù)脂也購(gòu)自CEM Corporation。Fmoc-(S)-Cys(Mmt)-OH和Fmoc-(S)-Cys(STmp)-OH購(gòu)自EMD Millipore(Burlington,MA)。N-氯代琥珀酰亞胺(NCS)、DL-二硫蘇糖醇(DTT)、4-甲基嗎啉(NMM)、N,N'-二異丙基碳二亞胺(DIC)、哌啶、哌嗪、三氟乙酸(TFA)和三異丙基硅烷(TIS)購(gòu)自Sigma-Aldrich（St. Louis,MO）。二氯甲烷(DCM)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、1-甲基-2- 吡咯烷酮(NMP)、乙醇、無(wú)水乙醚(Et2O)、乙酸、HPLC級(jí)水和乙腈購(gòu)自VWR(West Chester,賓夕法尼亞州)。LC-MS 級(jí)水(H2O)和LC-MS 級(jí)乙腈(MeCN)購(gòu)自Fisher Scientific(Waltham, MA)。
多肽合成：催產(chǎn)素（Oxytocin）, CYIQNCPLG-NH2

使用CEM Liberty Blue™自動(dòng)微波肽合成儀在0.526g Rink Amide ProTide LL樹(shù)脂（離子交換容量：0.19 meq/g ）上以0.10mmol規(guī)模合成多肽（圖2），以0.05mmol規(guī)模進(jìn)行二硫化物形成。用20%哌啶和0.1M Oxyma Pure的DMF溶液進(jìn)行脫保護(hù)。偶聯(lián)反應(yīng)在5倍過(guò)量的0.2M Fmoc-AA與1.0M DIC和1.0M Oxyma Pure的DMF中進(jìn)行(CarboMAX)⁸。Fmoc-(S)- Cys(Mmt)OH用作C端氨基酸。2%TFA的DCM溶液用于去保護(hù)Cys(Mmt)基團(tuán)。使用25mM NCS在DMF中的溶液形成二硫化物。使用具有95:2.5:2.5 TFA/H2O/TIS的CEM Razor™高通量肽切割系統(tǒng)進(jìn)行切割。裂解后，用無(wú)水乙醚沉淀肽并凍干過(guò)夜。

圖2：催產(chǎn)素

多肽合成: THR-123, CYFDDSSNVLCKKYRS-CO2H

使用CEM Liberty Blue自動(dòng)微波肽合成儀在0.556g Cl-MPA ProTide LL樹(shù)脂（離子交換容量：0.18 meq/g）上以0.10mmol規(guī)模合成肽（圖3）（以0.05mmol規(guī)模進(jìn)行二硫化物形成）。用20%哌啶和0.1M Oxyma Pure的DMF溶液進(jìn)行脫保護(hù)。偶聯(lián)反應(yīng)在5倍過(guò)量的0.2M Fmoc-AA 1.0M DIC和1.0M Oxyma Pure在DMF(CarboMAX)中進(jìn)行。8Fmoc-(S)-Cys(Mmt)-OH用于半胱氨酸C。A溶液DCM中2%TFA用于去保護(hù)Cys(Mmt)。使用25mM NCS在DMF中的溶液形成二硫化物。使用具有95:2.5:2.5 TFA/H2O/TIS 的CEM Razor高通量肽切割系統(tǒng)進(jìn)行切割。裂解后，用無(wú)水乙醚沉淀肽并凍干過(guò)夜。

圖3：THR-123

多肽合成 ：CHEC-7, CHEAAQC-CO2H

使用CEM Liberty Blue自動(dòng)微波肽合成儀在0.556g Cl-MPA ProTide LL樹(shù)脂（離子交換容量：0.18 meq/g）上以0.10mmol規(guī)模合成肽（圖4），以0.05 mmol規(guī)模進(jìn)行二硫化物形成。用10%哌嗪在1:9乙醇/NMP 中的溶液進(jìn)行脫保護(hù)。偶聯(lián)反應(yīng)在5倍過(guò)量的0.2M Fmoc-AA與1.0M DIC和1.0M Oxyma Pure在DMF中進(jìn)行(CarboMAX)⁸。Fmoc-(S)-Cys(Mmt)-OH用于半胱氨酸C。溶液DCM中2%TFA用于去保護(hù)Cys(Mmt)基團(tuán)。使用25mM NCS在DMF中的溶液形成二硫化物。使用具有95:2.5:2.5 TFA/H2O/TIS的CEM Razor高通量肽切割系統(tǒng)進(jìn)行切割。裂解后，用無(wú)水乙醚沉淀肽并凍干過(guò)夜。

圖4：CHEC-7

多肽合成：Conotoxin-SI, ICCNPACGPKYSC-NH2

使用CEM Liberty Blue自動(dòng)微波肽合成儀在0.526g Rink Amide ProTide LL樹(shù)脂（離子交換容量：0.19 meq/g）上以0.10mmol規(guī)模合成肽（圖5）（以0.05mmol規(guī)模進(jìn)行二硫化物形成）。用20%哌啶和0.1M Oxyma Pure的DMF溶液進(jìn)行脫保護(hù)。偶聯(lián)反應(yīng)在5倍過(guò)量的0.2M Fmoc-AA與1.0M DIC和1.0M Oxyma Pure的DMF(CarboMAX)⁸中進(jìn)行。Fmoc-(S)Cys(Mmt)-OH用于C，F(xiàn)moc-(S)-Cys(STmp)-OH用于半胱氨酸C。5% DTT和0.1M的NMM的DMF溶液用于去保護(hù)Cys(STmp)基團(tuán)。使用25mM NCS在DMF中的溶液形成第一個(gè)二硫化物。2% TFA在DCM中的溶液用于去保護(hù)Cys(Mmt)。使用相同的NCS在DMF中的溶液形成第二個(gè)二硫鍵。使用具有95:2.5:2.5 TFA/H2O/TIS的CEM Razor高通量肽切割系統(tǒng)進(jìn)行切割。裂解后，用無(wú)水乙醚沉淀肽并凍干過(guò)夜。

圖5：Conotoxin-SI

多肽分析

在配備有PDA檢測(cè)器的Waters Acquity UPLC系統(tǒng)上分析肽，該檢測(cè)器配備Acquity UPLC BEH C8柱（1.7mm和2.1x100mm）。UPLC系統(tǒng)連接到Waters 3100 Single Quad MS用于結(jié)構(gòu)測(cè)定。在Waters MassLynx軟件上進(jìn)行峰分析。使用0.05% TFA的(i)H₂O和(ii)MeCN溶液梯度洗脫進(jìn)行分離。

 

結(jié)果

Liberty Blue自動(dòng)微波肽合成儀上使用微波增強(qiáng)SPPS產(chǎn)合成催產(chǎn)素，產(chǎn)生了純度為69%的目標(biāo)肽（圖6）。

圖6：催產(chǎn)素的UPLC色譜圖

在Liberty Blue自動(dòng)微波肽合成儀上使用微波增強(qiáng)SPPS合成THR-123，產(chǎn)生了純度為77%的目標(biāo)肽（圖7）。

圖7：THR-123的UPLC 色譜圖

在Liberty Blue自動(dòng)微波肽合成儀上使用微波增強(qiáng)SPPS合成CHEC-7，產(chǎn)生了80%純度的目標(biāo)肽（圖8）。注意：5.72 min（參見(jiàn)圖9）和5.85min（參見(jiàn)圖10）處的峰均具有目標(biāo)肽質(zhì)量，不是差向異構(gòu)化的結(jié)果。

圖8：CHEC-7 的UPLC色譜圖

圖9：保留時(shí)間為5.72分鐘的峰質(zhì)譜圖

圖10：保留時(shí)間為5.85 分鐘的峰質(zhì)譜圖

Liberty Blue自動(dòng)微波肽合成儀上使用微波增強(qiáng)SPPS合成芋螺毒素-SI，產(chǎn)生了純度為67%的目標(biāo)肽（圖11）。

圖11 ：Conotoxin-SI 的UPLC色譜圖

 

結(jié)論

使用自動(dòng)微波增強(qiáng)多肽固相合成（SPPS）可以快速有效地合成二硫鍵橋接環(huán)肽。催產(chǎn)素的常規(guī)室溫合成需要超過(guò)13小時(shí)才能生成二硫鍵橋接肽⁷。使用微波增強(qiáng)SPPS，該肽在3小時(shí)內(nèi)合成，純度為69%。在3小時(shí)內(nèi)以高純度（分別為77%和80%產(chǎn)率）快速合成了具有C末端酸的環(huán)狀二硫鍵橋肽THR-123和CHEC-7。含有兩個(gè)二硫鍵的芋螺毒素-SI的常規(guī)室溫合成需要20小時(shí)⁷。另一方面，微波增強(qiáng)的SPPS可在4小時(shí)內(nèi)提供純度為67%的肽。

 

參考文獻(xiàn)

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[7]Postma, T. M.; Albericio, F. Org. Lett. 2013, 15 (3), 616–619. 

[8]CEM Application Note (AP0124) - “CarboMAX - Enhanced  Peptide Coupling at Elevated Temperature”. 

[9]CEM Technical Note (P/N: 600837) - “Cl-MPA ProTide and  Cl-TCP(Cl) ProTide Resin Loading and Protected Cleavage  Procedures”.