小膠質(zhì)細(xì)胞是大腦關(guān)鍵的免疫細(xì)胞，生理狀態(tài)下發(fā)揮免疫監(jiān)視，調(diào)控神經(jīng)元功能穩(wěn)態(tài)的作用，病理狀態(tài)下參與多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，并表達(dá)疾病相關(guān)的基因。研究小膠質(zhì)細(xì)胞的功能通過標(biāo)記它、操縱它實(shí)現(xiàn)的。

目前可通過敲入基因的手段實(shí)現(xiàn)對小膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記，通過病毒載體工具實(shí)現(xiàn)對小膠質(zhì)細(xì)胞的特異性操縱�；�于病毒的基因傳遞系統(tǒng)的兩個主要組成部分是：首先由結(jié)構(gòu)蛋白和酶組成的包裝元件，合成病毒；其次，在細(xì)胞類型特異性啟動子下驅(qū)動的編碼感興趣基因的轉(zhuǎn)移載體。

早期利用2型和6型腺相關(guān)病毒AAV為載體， F4/80和 CD68為啟動子實(shí)現(xiàn)特異性標(biāo)記小膠質(zhì)細(xì)胞，但是感染細(xì)胞的效率低、存在部分脫靶、引起組織免疫反應(yīng)等問題。

2022年7月25日北京生命科學(xué)研究所羅敏敏林睿團(tuán)隊(duì)開發(fā)了高效、便捷、一體化操縱小膠質(zhì)細(xì)胞的AAV病毒載體工具，極大促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞的功能研究。
 

 

1、 體內(nèi)外高效感染小膠質(zhì)細(xì)胞的AAV病毒突變體

研究人員通過體外實(shí)驗(yàn)通過隨機(jī)插入氨基酸序列引起突變，篩選了能夠?qū)崿F(xiàn)較高轉(zhuǎn)染小膠質(zhì)細(xì)胞效率的衣殼蛋白AAV-cMG.QRP (~55%) 和AAV-cMG.WPP (~75%)。相比之下，AAV5衣殼蛋白感染效率不到12%, AAV9衣殼蛋白感染效率不到10%,轉(zhuǎn)染效率最高的AAV8也只到34%。

為了實(shí)現(xiàn)更高的感染效率，他們對AAV-cMG.QRP和AAV-cMG.WPP進(jìn)行突變篩選，通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在 594-596 位包含PAD氨基酸序列的AAV-cMG.QRP突變體（AAV-cMG），能夠達(dá)到86%的感染效率。

通過Cx3cr1-cre工具小鼠在體篩選了在587–589氨基酸序列兩個AAV-cMG.WPP突變體AAV-MG1.1 和 AAV-MG1.2，這兩種突變體包裝的AAV病毒能夠在體感染80%以上的小膠質(zhì)細(xì)胞，而且不引起小膠質(zhì)細(xì)胞的激活。
 

圖1：高效感染小膠質(zhì)細(xì)胞的AAV-MG1.1和 AAV-MG1.2
 

2、感染小膠質(zhì)細(xì)胞的AAV病毒突變體多應(yīng)用場景

將AAV-MG1.2包裝成鈣離子指示劑注射到Cx3cr1-cre工具小鼠體感皮層后，腹腔注射脂多糖刺激后可明顯觀察到體感皮層小膠質(zhì)細(xì)胞胞體鈣離子信號的增加。這就表明AAV-MG1.2可用于追蹤小膠質(zhì)細(xì)胞活性變化。

將AAV-MG1.2包裝成ATP熒光探針注射到Cx3cr1-cre工具小鼠體感皮層后，在脂多糖刺激2小時后可小膠質(zhì)細(xì)胞胞體ATP熒光增加達(dá)到高峰，這一增加可持續(xù)6小時。這就表明AAV-MG1.2可用于追蹤小膠質(zhì)細(xì)胞胞外ATP水平變化。

進(jìn)一步利用AAV-MG1.2表達(dá)Cas9系統(tǒng)在向?qū)�RNA靶向嘌呤能受體基因P2ry12后可實(shí)現(xiàn)特異性敲除小膠質(zhì)細(xì)胞的P2ry12。在敲除P2ry12后，小膠質(zhì)細(xì)胞不能快速募集到組織損傷的部位，表明小膠質(zhì)細(xì)胞功能受損。這就表明AAV-MG1.2可用于基因編輯小膠質(zhì)細(xì)胞的功能基因。

總結(jié)

本文開發(fā)了能夠高效感染小膠質(zhì)細(xì)胞的AAV突變體AAV-MG1.1 and AAV-MG1.2，利用這些突變體攜帶不同的功能基團(tuán)可實(shí)現(xiàn)標(biāo)記、觀察小膠質(zhì)細(xì)胞和敲除特異性表達(dá)在小膠質(zhì)細(xì)胞的基因，為小膠質(zhì)細(xì)胞的功能研究提供了“利器”。
 

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