引言：
新型冠狀病毒（severeacuterespiratorysyndromecoronavirus2,SARS-CoV-2）引起的新型冠狀病毒肺炎（coronavirusdisease,COVID-19）繼續(xù)在全球肆虐。WHO報(bào)道，截至2020年6月1日11：11am，全球確診病例6040609例，死亡病例230104例。對(duì)SARS-CoV-2進(jìn)行核酸檢測(cè)，是WHO目前推薦的識(shí)別感染病例的方法。李克強(qiáng)總理主持召開中央應(yīng)對(duì)新冠肺炎疫情工作領(lǐng)導(dǎo)小組會(huì)議提出：提高新冠病毒核酸檢測(cè)能力，加快快速便捷檢測(cè)試劑和設(shè)備研發(fā)生產(chǎn)，縮短檢測(cè)時(shí)間，推進(jìn)重點(diǎn)人群“應(yīng)檢盡檢”、其他人群“愿檢盡檢”，推動(dòng)各地互通互認(rèn)檢測(cè)結(jié)果，促進(jìn)精準(zhǔn)防控、人員流動(dòng)和全面復(fù)工復(fù)產(chǎn)。
深圳市寶安中醫(yī)院（集團(tuán)）檢驗(yàn)科PCR實(shí)驗(yàn)室自2020年3月10日開始SARS-CoV-2的核酸檢測(cè)工作，截至2020年5月11日，共檢測(cè)19522份標(biāo)本。采用中山大學(xué)達(dá)安生物有限公司生產(chǎn)的“新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑盒（熒光PCR法）”，試劑盒采用的內(nèi)標(biāo)（IC）為人類RNaseP基因（RP）。在實(shí)驗(yàn)工作中，經(jīng)常出現(xiàn)內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增曲線不出現(xiàn)典型“S”型或者內(nèi)標(biāo)完全無(wú)擴(kuò)增曲線的情況，導(dǎo)致重復(fù)檢測(cè)，拖延了報(bào)告發(fā)放時(shí)間，給臨床診療工作帶來(lái)不便。本實(shí)驗(yàn)室在經(jīng)過一系列實(shí)驗(yàn)之后，對(duì)達(dá)安公司試劑盒說明書中給出的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行了部分更改優(yōu)化，經(jīng)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)步驟后，內(nèi)標(biāo)的擴(kuò)增曲線及起始循環(huán)Ct值均有明顯改善，現(xiàn)具體報(bào)道如下。

一、對(duì)象與方法
1.1實(shí)驗(yàn)材料
1.1.1實(shí)驗(yàn)試劑
新型冠狀病毒SARS-CoV-2核酸檢測(cè)試劑盒（熒光PCR法）和樣本釋放劑；
熒光定量PCR擴(kuò)增儀；超級(jí)恒溫水槽；
多管快速混合器；
迷你離心機(jī)；
1.1.2實(shí)驗(yàn)對(duì)象
2020年3月10日至2020年5月11寶安中醫(yī)院發(fā)熱門診、復(fù)工門診及隔離病房送檢的進(jìn)行SARS-CoV-2的核酸檢測(cè)的咽拭子標(biāo)本共19522份。
1.1.3咽拭子采集及保存
采樣人員著三級(jí)防護(hù)，用達(dá)安公司生產(chǎn)的專用樣本采集拭子擦拭扁桃體和咽后壁，將拭子頭浸入含有樣本保存液和核酸釋放劑的保存管中。樣本采集完后置0~4℃保存，24h內(nèi)完成檢測(cè)。
1.2實(shí)驗(yàn)方法
實(shí)驗(yàn)及醫(yī)護(hù)人員均嚴(yán)格按照國(guó)家衛(wèi)生健康委辦公廳印發(fā)的《新型冠狀病毒實(shí)驗(yàn)室生物安全指南》及《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理辦法》等相關(guān)文件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作和生物安全防護(hù)。
1.2.1原樣本釋放劑使用說明書中實(shí)驗(yàn)方法
將樣本采集管置于56℃水浴箱滅活30min，室溫條件下，將采集管振蕩1min，靜置5min，重復(fù)3次后，瞬時(shí)離心，直接吸取上清液5μL為模板加入PCR體系進(jìn)行擴(kuò)增。
1.2.2本實(shí)驗(yàn)室優(yōu)化后實(shí)驗(yàn)方法
樣本采集管置于56℃水浴箱滅活40min[8-9]。室溫條件下，2800r/min充分振蕩2min，立即4000r/min離心30s，直接吸取上清液5μL為模板加入PCR體系進(jìn)行擴(kuò)增（加樣時(shí)如吸到雜質(zhì)或混濁物棄去，重新吸取上層澄清液體）。
1.2.3優(yōu)化后實(shí)驗(yàn)方法的陽(yáng)性標(biāo)本檢測(cè)性能評(píng)價(jià)
取2020年第一次廣東省臨檢中心室間質(zhì)量評(píng)價(jià)（externalqualityassessment,EQA）SARS-CoV-2陽(yáng)性標(biāo)本7份（2020004~2020010），用1.2.1及1.2.2所述方法分別檢測(cè)，每份樣本平行檢測(cè)３次，重復(fù)３次實(shí)驗(yàn)，觀察兩種方法對(duì)陽(yáng)性結(jié)果Ct值的影響。
1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
采用GraphPadPrism7.00軟件分析統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用（x±s）表示，采取單因素方差分析與配對(duì)t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

二、結(jié)果
2.1優(yōu)化前后各樣本內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增曲線比較
優(yōu)化前，各樣本內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增曲線在Ct24~44之間散在分布，Ct38之后大多無(wú)明顯“S”型曲線，不少樣本內(nèi)標(biāo)未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線；經(jīng)優(yōu)化后，各樣本內(nèi)標(biāo)的擴(kuò)增曲線明顯優(yōu)于優(yōu)化前，擴(kuò)增曲線集中在22~34之間，且全部呈現(xiàn)典型“S”型曲線，見圖1。


2.2優(yōu)化前后復(fù)查率比較
經(jīng)優(yōu)化后，樣本復(fù)查率較優(yōu)化前有明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3.889，P=0.0258），結(jié)果詳見表1，圖2A。


2.3優(yōu)化前后各樣本內(nèi)標(biāo)Ct值比較
經(jīng)優(yōu)化后，各樣本內(nèi)標(biāo)的擴(kuò)增起始循環(huán)Ct值明顯小于優(yōu)化前（t=5.937,P<0.01），陽(yáng)性對(duì)照N基因及ORF1a/b基因的Ct值，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖2。


2.4優(yōu)化前后陽(yáng)性質(zhì)評(píng)標(biāo)本Ct值
優(yōu)化前后，陽(yáng)性質(zhì)評(píng)標(biāo)本N基因（F=1.032,P=0.9701)與ORF1a/b基因（F=1.262,P=0.7848)，Ct值均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖3。


三、討論
2003年SARS-CoV-2及2012年MERS-CoV引起的流行病學(xué)數(shù)據(jù)證明，對(duì)COVID-19建立快速、高通量、高敏感及高特異性的實(shí)驗(yàn)室診斷對(duì)于病例早診斷、密切接觸者追蹤和感染控制措施合理化制定至關(guān)重要。因?yàn)镾ARS-CoV-2至少需要3d才能在選定的細(xì)胞系中引起明顯的細(xì)胞病變，且病毒分離培養(yǎng)需要3級(jí)生物安全設(shè)施，大多數(shù)醫(yī)療機(jī)構(gòu)都不具備，因此以病毒培養(yǎng)來(lái)建立快速診斷是不現(xiàn)實(shí)的；而SARS-CoV-2與SARS-CoV存在82%的基因同源性，血清學(xué)抗原抗體檢測(cè)可能存在交叉反應(yīng)[11]。由于這些局限性，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄-PCR（RT-PCR）技術(shù)對(duì)SARSCoV-2進(jìn)行核酸檢測(cè)仍然是最主要的全球COVID-19切實(shí)可行的實(shí)驗(yàn)室診斷檢測(cè)方法。
雖然因?yàn)?ldquo;假陰性”的問題使得SARS-CoV-2核酸檢測(cè)存在爭(zhēng)議，自2020年1月15日至3月15日，國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)先后共發(fā)布了七版《新型冠狀病毒肺炎診療方案》（試行1-7版），核酸檢測(cè)陽(yáng)性一直是確診病例的診斷標(biāo)準(zhǔn)之一。由于國(guó)內(nèi)大部分檢測(cè)點(diǎn)都是采集咽拭子做為標(biāo)本，在疾病早期或是無(wú)癥狀潛伏期，上呼吸道局部病毒載量低；標(biāo)本采集后沒有按正確方法貯存及運(yùn)輸?shù)鹊仍�因都可能造成檢測(cè)結(jié)果的假陰性。另外，由于新冠病毒在呼吸道是寄生于呼吸道上皮細(xì)胞，如果沒有采集到足夠數(shù)量的細(xì)胞，也會(huì)造成檢測(cè)結(jié)果的假陰性。因此，目前國(guó)內(nèi)各檢測(cè)試劑公司開發(fā)的試劑盒內(nèi)多采用了RNaseP基因（RP）做為內(nèi)標(biāo)（IC），來(lái)監(jiān)測(cè)標(biāo)本是否采集合格。在結(jié)果判讀時(shí)，如果IC沒有出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線或者Ct值>40，則被認(rèn)為標(biāo)本質(zhì)量差，沒有采集到足夠的人類上皮細(xì)胞，需要復(fù)查。
本實(shí)驗(yàn)室采用的達(dá)安公司出品的“新型冠狀病毒SARS-CoV-2核酸檢測(cè)試劑盒（熒光PCR法）”也是采用RP做為IC。同時(shí)為了最大程度減少職業(yè)暴露，加大生物安全防護(hù)力度，達(dá)安基因在開發(fā)試劑盒的同時(shí)，推出了采用樣本釋放劑一步法提取SARS-CoV-2核酸，力求在病毒核酸提取操作時(shí)減少開蓋次數(shù)，減少暴露風(fēng)險(xiǎn)，從而在最大程度保護(hù)實(shí)驗(yàn)人員的基礎(chǔ)上高質(zhì)高效地提取到足夠數(shù)目的RNA模板進(jìn)行擴(kuò)增。
但是在實(shí)驗(yàn)過程中，發(fā)現(xiàn)經(jīng)一步法提取核酸進(jìn)行擴(kuò)增后，經(jīng)常有IC沒有典型的擴(kuò)增曲線或者Ct值>40的情況。此種情況，一般只能延遲報(bào)告發(fā)放，同時(shí)實(shí)驗(yàn)室采用達(dá)安基因給出的補(bǔ)救方法進(jìn)行進(jìn)一步的復(fù)查實(shí)驗(yàn)，IC出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線且Ct值<40后，實(shí)驗(yàn)室才能發(fā)放報(bào)告。大多數(shù)標(biāo)本在經(jīng)補(bǔ)救方法復(fù)查后，IC會(huì)有典型的“S”型擴(kuò)增曲線。但仍有少部分補(bǔ)救方法處理后仍有IC無(wú)擴(kuò)增現(xiàn)象，則考慮為標(biāo)本質(zhì)量不合格，通知臨床科室重新采集標(biāo)本送檢。由于臨床上發(fā)熱門診及手術(shù)室都依據(jù)SARS-CoV-2核酸檢測(cè)結(jié)果才開展下一步的診療，報(bào)告發(fā)放的延遲給臨床上的診療工作帶來(lái)了一定的影響。因此，降低復(fù)查率勢(shì)在必行。
目前主流的磁珠法提取核酸過程中由于磁珠與核酸的特異性結(jié)合使得提取的核酸純度高，濃度大，并且靈敏度，重復(fù)性都很好。而一步法雖然快速高效，但卻沒有磁珠法提取的核酸純度高，可能是一步法提取的核酸模板中存在有非特異性物質(zhì)干擾其與引物的特異性結(jié)合，導(dǎo)致擴(kuò)增結(jié)果不理想。因此，本實(shí)驗(yàn)室考慮優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方法，延長(zhǎng)振蕩時(shí)間至2min，力求讓標(biāo)本中的核酸充分釋放；增加了離心力和離心時(shí)間，并且確保吸取上層澄清液體加樣，從而減少非特異性物質(zhì)的干擾。
優(yōu)化前后比較的結(jié)果顯示，優(yōu)化前，樣本中內(nèi)標(biāo)的擴(kuò)增曲線會(huì)有少數(shù)沒有出現(xiàn)典型的“S”型，且有個(gè)別內(nèi)標(biāo)沒起，平直地處于閾值線以下的情況，Ct值明顯靠后且分散；經(jīng)優(yōu)化后，不但所有樣本的內(nèi)標(biāo)都出現(xiàn)了典型的“S”型擴(kuò)增曲線，而且擴(kuò)增起始循環(huán)Ct值的平均值明顯小于優(yōu)化前；同時(shí)陽(yáng)性對(duì)照N基因與ORF1a/b基因Ct值與優(yōu)化前比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)中采用了廣東省臨檢中心下發(fā)的2020年第一批次的室間質(zhì)評(píng)陽(yáng)性標(biāo)本對(duì)優(yōu)化方法的陽(yáng)性標(biāo)本檢出能力進(jìn)行性能評(píng)價(jià)，結(jié)果各標(biāo)本的N基因及ORF1a/b基因Ct值兩種方法比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這說明在不影響陽(yáng)性標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果的情況下，優(yōu)化方 法大大提高了內(nèi)標(biāo)的檢出率，復(fù)查率從優(yōu)化前的2.226%降至0.679%，整體較優(yōu)化前有了明顯地改善。
經(jīng)過優(yōu)化后，雖然大大提高了內(nèi)標(biāo)檢出率，但還是存在一定比例的復(fù)查率，很多內(nèi)標(biāo)不出的標(biāo)本出現(xiàn)或渾濁、或粘稠、或?yàn)榭Х壬�血性樣本，存在太多干擾物影響檢測(cè)結(jié)果，因此建議臨床科室重新采集標(biāo)本送檢。并加強(qiáng)對(duì)標(biāo)本采集人員的技術(shù)培訓(xùn)。
科室由于實(shí)驗(yàn)室設(shè)備及人員緊張，暫時(shí)不具備應(yīng)用磁珠法提取SARS-CoV-2核酸的條件，故整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程僅是優(yōu)化前后方法比較，存在一定的局限性。本實(shí)驗(yàn)室2020年兩次參加廣東省臨檢中心SARS-CoV2核酸檢測(cè)室間質(zhì)評(píng)成績(jī)均為優(yōu)秀，表明雖然釋放劑一步法提取核酸的效率沒有傳統(tǒng)磁珠法高，但尚可滿足臨床診療及復(fù)工復(fù)學(xué)篩查需求。此法操作簡(jiǎn)便，降低了實(shí)驗(yàn)室工作人員的職業(yè)暴露風(fēng)險(xiǎn)，且經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室優(yōu)化部分實(shí)驗(yàn)操作后，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可接受。