在我國(guó)，乳腺癌發(fā)病率呈逐漸上升趨勢(shì)，是嚴(yán)重危害婦女健康的惡性腫瘤。巨噬細(xì)胞是乳腺癌微環(huán)境的主要細(xì)胞類型。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞通常具有促癌和免疫抑制功能，與不良預(yù)后相關(guān)，但也有報(bào)道表明同一腫瘤內(nèi)可能同時(shí)存在具有促癌和抗癌功能的不同巨噬細(xì)胞亞群。因此，本文研究者使用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)分析了腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的異質(zhì)性特征，并發(fā)現(xiàn)一種新的抗癌巨噬細(xì)胞亞群，為靶向巨噬細(xì)胞的癌癥治療提供了新的思路。

文章題目：Tissue-resident FOLR2+ macrophages associate with CD8+T cell infiltration in human breast cancer
中文題目：組織駐留型FOLR2+巨噬細(xì)胞與人乳腺癌中CD8+ T細(xì)胞浸潤(rùn)有關(guān)
發(fā)表時(shí)間：2022年3月
期刊名稱：Cell
影響因子：41.582
實(shí)驗(yàn)平臺(tái)：流式細(xì)胞分選技術(shù)、10x Chromium單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、IHC、激光共聚焦顯微成像技術(shù)等
DOI：10.1016/j.cell.2022.02.021

研究思路

研究思路

研究?jī)?nèi)容
1、APOE表達(dá)鑒定乳腺癌中的TAMs
研究者使用一個(gè)未接受過(guò)治療的管腔型乳腺癌（BC）患者隊(duì)列樣品，分析了匹配的原發(fā)腫瘤中非轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)（LN）內(nèi)的單核巨噬細(xì)胞數(shù)量，并發(fā)現(xiàn)癌轉(zhuǎn)移LNs中CD1c-CD14+單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞數(shù)量較非轉(zhuǎn)移LNs顯著增加（圖1A），CD14+細(xì)胞浸潤(rùn)與LNs腫瘤侵襲程度有關(guān)（圖1B）。接下來(lái)，研究者從癌轉(zhuǎn)移LNs、原發(fā)腫瘤和血液中分離出單核巨噬細(xì)胞并進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（圖1C），得到了約18000個(gè)髓系細(xì)胞并進(jìn)行細(xì)胞注釋（圖1D和E）。此外，APOE同源表達(dá)選擇性地將TAM與CD14+單核細(xì)胞和CD1c+DCs區(qū)分出來(lái)（圖1F）。從蛋白表達(dá)水平上，利用染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)APOE和CCR2可以將巨噬細(xì)胞/TAMs與CD1c-CD14+細(xì)胞內(nèi)的單核細(xì)胞區(qū)分開(kāi)，隨著腫瘤負(fù)荷增加，CD14+細(xì)胞內(nèi)APOE+巨噬細(xì)胞比例也隨之增加，而CCR2+單核細(xì)胞比例降低（圖1G）。綜上所述，研究者找到了APOE，作為鑒定管腔型BC原發(fā)腫瘤和癌轉(zhuǎn)移LNs中巨噬細(xì)胞的特異標(biāo)志物。

Fig.1 APOE表達(dá)定義了乳腺癌中的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞

2、單細(xì)胞RNA測(cè)序揭示了兩種APOE+巨噬細(xì)胞亞群
通過(guò)對(duì)找到的APOE+TAMs進(jìn)行亞亞群分析，得到了三個(gè)亞亞群，系統(tǒng)聚類分析發(fā)現(xiàn)三個(gè)亞亞群中0和1在轉(zhuǎn)錄上關(guān)系更近（圖2A和B）。利用SCENIC進(jìn)一步探究巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性發(fā)現(xiàn)0和1有約一半的共同調(diào)控子，而2則有一些獨(dú)特的調(diào)控子（圖2C）。基因表達(dá)差異分析表明，FOLR2、SEPP1、SLC40A1、MRC1和LYVE1在2中高表達(dá)，而TREM2、SPP1、ISG15則在0和1中高表達(dá)（圖2D）。其中，FOLR2是2的定義marker，TREM2是0和1的定義marker�？傊�，APOE+巨噬細(xì)胞中包含2種細(xì)胞類型：TREM2+或FOLR2+巨噬細(xì)胞（圖2E）。然而，在TAMs的細(xì)胞表面未能檢測(cè)到TREM2蛋白的表達(dá)，不過(guò)在亞亞群1（Trem2high巨噬細(xì)胞）中發(fā)現(xiàn)CADM1的特異性表達(dá)，其染色也呈陽(yáng)性（圖2F和G）。從原發(fā)癌和癌轉(zhuǎn)移LNs中分選出FOLR2+CADM1-和FOLR2lowCADM1+巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)前者呈典型的巨噬細(xì)胞形態(tài)并充滿空泡，而后者體積更小，形態(tài)更接近單核細(xì)胞（圖2G）。對(duì)FORL2+CADM1-巨噬細(xì)胞、FOLR2lowCADM1+巨噬細(xì)胞和CD14+CCR2+單核細(xì)胞進(jìn)行bulk RNA測(cè)序，發(fā)現(xiàn)FOLR2+巨噬細(xì)胞與另外兩種細(xì)胞距離較遠(yuǎn)，且高表達(dá)FOLR2、SEPP1、SLC40A1和LYVE1（圖2H-J）。這些結(jié)果表明，乳腺TAMs由兩種細(xì)胞群組成，它們可以通過(guò)TREM2/CADM1和FOLR2的互斥表達(dá)區(qū)分。

Fig.2 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序揭示了兩個(gè)APOE+巨噬細(xì)胞亞群

3、FOLR2+巨噬細(xì)胞是組織駐留性巨噬細(xì)胞研究者結(jié)合近期研究結(jié)果和自己的發(fā)現(xiàn)，認(rèn)為TREM2+CADM1+巨噬細(xì)胞來(lái)源于腫瘤發(fā)展過(guò)程中循環(huán)單核細(xì)胞的浸潤(rùn)，而FOLR2+巨噬細(xì)胞的起源尚不清楚。為了解決這個(gè)問(wèn)題，研究者利用質(zhì)譜流式技術(shù)對(duì)健康組織和乳腺腫瘤病變組織中的FOLR2+巨噬細(xì)胞進(jìn)行了定量，發(fā)現(xiàn)在APOE+巨噬細(xì)胞中，F(xiàn)OLR2+巨噬細(xì)胞富集在正常組織和癌旁中，并隨著腫瘤發(fā)展，其比例被FOLR2-巨噬細(xì)胞稀釋（包括TREM2+巨噬細(xì)胞）（圖3A），但由于正常組織和腫瘤中FOLR2+巨噬細(xì)胞在總活細(xì)胞比例中保持穩(wěn)定，說(shuō)明在腫瘤病變中，F(xiàn)OLR2+巨噬細(xì)胞群體并沒(méi)有減少。通過(guò)對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中不同亞型的BC樣本的分析，也在轉(zhuǎn)錄水平上證實(shí)了FOLR2+巨噬細(xì)胞在鄰近正常組織比腫瘤病變組織富集程度更高，IHC分析顯示FOLR2+巨噬細(xì)胞在BC各亞型中均有表達(dá)（圖3B和C）。此外，前面的研究中發(fā)現(xiàn)FOLR2+巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)LYVE1和MRC1/CD206，這些都是血管周圍（PV）巨噬細(xì)胞的marker，共聚焦成像顯示FOLR2+CD206+巨噬細(xì)胞確實(shí)位于腫瘤和鄰近組織中CD31+血管附近（圖3D）。綜上所述，F(xiàn)OLR2+巨噬細(xì)胞是與健康乳腺（MG）相關(guān)的PV組織駐留巨噬細(xì)胞（TRM）。
接下來(lái)，研究者利用小鼠模型進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序來(lái)分析巨噬細(xì)胞，共鑒定到3個(gè)巨噬細(xì)胞亞群，其中兩個(gè)表達(dá)Cadm1(0和1兩個(gè)亞群)（圖3E），第三個(gè)離散亞群（2號(hào)亞群）為Folr2+Mrc1+巨噬細(xì)胞，人和小鼠的FOLR2+巨噬細(xì)胞共同表達(dá)FOLR2、MRC1、LYVE1和MAF（圖3F）。為了探索人和小鼠FOLR2+巨噬細(xì)胞之間的相似性，研究者在單個(gè)細(xì)胞水平進(jìn)行同源基因的相似性分析，證實(shí)了小鼠Folr2+巨噬細(xì)胞和人FOLR2+巨噬細(xì)胞的一致，說(shuō)明FOLR2+巨噬細(xì)胞在小鼠和人管腔型乳腺癌之間是保守的（圖3G）。在健康（WT）、病變前、腫瘤性病變、早期癌和晚期癌小鼠中分析FOLR2+和CADM1+巨噬細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化。其中，F(xiàn)OLR2+巨噬細(xì)胞約占健康MG巨噬細(xì)胞總數(shù)的80%，并隨著腫瘤進(jìn)展而逐漸減少，在晚期癌中達(dá)到最低值（圖3H）。根據(jù)上述結(jié)果，研究者得出結(jié)論FOLR2+巨噬細(xì)胞是一種在晚期癌癥中持續(xù)存在且進(jìn)化上保守的TRM亞群。

Fig.3 FOLR2+ 巨噬細(xì)胞是組織駐留的巨噬細(xì)胞

4、FOLR2+巨噬細(xì)胞與BC患者的生存期增加相關(guān)
通常認(rèn)為巨噬細(xì)胞促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)并抑制抗腫瘤免疫。因此，研究者接下來(lái)探求FOLR2+巨噬細(xì)胞是否同樣與BC患者較差的生存率有關(guān)。本研究中發(fā)現(xiàn)的三個(gè)巨噬細(xì)胞亞群（圖2A）均表達(dá)了C1QA、C1QB和C1QC，足以區(qū)分巨噬細(xì)胞和其他白細(xì)胞譜系。FOLR2、SEPP1 和 SLC40A1能將FOLR2+巨噬細(xì)胞和其他巨噬細(xì)胞與白細(xì)胞譜系區(qū)分開(kāi)來(lái)（圖4A和B）。生存分析發(fā)現(xiàn)最高水平的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)與較差的總生存期相關(guān)，但是高水平表達(dá)的FOLR2+巨噬細(xì)胞特征基因則與總生存期增加相關(guān)，在不同亞型BC患者隊(duì)列中也能發(fā)現(xiàn)這一點(diǎn)（圖4C）。此外，通過(guò)染色成像計(jì)算FOLR2+巨噬細(xì)胞密度，發(fā)現(xiàn)其密度與患者生存期呈正相關(guān)（圖4D和E）。上述這些結(jié)果表明 FOLR2基因特征和 FOLR2+巨噬細(xì)胞豐度與BC患者的更好預(yù)后相關(guān)。

Fig.4 FOLR2+巨噬細(xì)胞與乳腺癌患者的生存期增加相關(guān)

5、FOLR2+巨噬細(xì)胞存在于腫瘤基質(zhì)中，并且在空間上與癌癥中的TREM2+巨噬細(xì)胞分離除了乳腺癌，研究者繼續(xù)探究FOLR2+巨噬細(xì)胞在不同腫瘤中是否存在，為此分析了80多個(gè)腫瘤切片中FOLR2+細(xì)胞的分布，并在這些癌癥中發(fā)現(xiàn)了FOLR2+巨噬細(xì)胞，其持續(xù)存在于腫瘤基質(zhì)內(nèi)，很少浸潤(rùn)腫瘤巢（圖5A）。對(duì)多種腫瘤連續(xù)切片進(jìn)行FOLR2和TREM2的染色分析，發(fā)現(xiàn)TREM2+巨噬細(xì)胞在腫瘤巢附近浸潤(rùn)或分布，而FOLR2+巨噬細(xì)胞主要位于腫瘤基質(zhì)。某些癌癥中TREM2+巨噬細(xì)胞同時(shí)存在于腫瘤基質(zhì)和腫瘤巢，而FOLR2+巨噬細(xì)胞仍位于腫瘤基質(zhì)中（圖5B）。為了測(cè)試腫瘤基質(zhì)中巨噬細(xì)胞豐度是否與臨床結(jié)果有關(guān)，分析了一個(gè)BC瘤周基質(zhì)區(qū)域基因芯片數(shù)據(jù)集結(jié)果，發(fā)現(xiàn)FOLR2特征基因集與更好的生存期密切相關(guān)，低FOLR2則比較差，與TREM2相反（圖5D）。研究者得出結(jié)論FOLR2+巨噬細(xì)胞和TREM2+巨噬細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中的空間分布彼此分離，它們?cè)谀[瘤基質(zhì)中的豐度與BC患者不同的臨床結(jié)果有關(guān)。

Fig.5 FOLR2+巨噬細(xì)胞與TREM2+巨噬細(xì)胞在空間上分離

6、FOLR2+巨噬細(xì)胞在CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)的腫瘤中富集，并與癌癥中的淋巴聚集體共定位利用FOLR2特征基因集或FOLR2表達(dá)來(lái)將FOLR2+巨噬細(xì)胞的豐度與腫瘤微環(huán)境中的其他免疫和基質(zhì)細(xì)胞類型相關(guān)聯(lián)，結(jié)果表明FOLR2特征基因集（或FOLR2）與CD8+ T細(xì)胞、DC、B細(xì)胞和三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)（TLSs）等已知的抗腫瘤免疫因子呈正相關(guān)（圖6A）。水平最高的FOLR2表達(dá)與多淋巴細(xì)胞譜系的協(xié)調(diào)浸潤(rùn)和TLS的基因特征一致（圖6B）。腫瘤中的FOLR2表達(dá)與各種免疫通路之間存在很強(qiáng)的相關(guān)性。與CDAM1+TREM2+巨噬細(xì)胞相比，在bulk RNA測(cè)序數(shù)據(jù)集中，對(duì)FOLR2+巨噬細(xì)胞富集了趨化性和免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)功能模塊通路，表明FOLR2+巨噬細(xì)胞是抗腫瘤免疫啟動(dòng)的免疫環(huán)境的一部分（圖6C）。因?yàn)镃D8+ T細(xì)胞在包括BC在內(nèi)的各種癌癥類型中與更好的生存期有關(guān)，因此研究者探求FOLR2+巨噬細(xì)胞是否與腫瘤浸潤(rùn)性CD8+T細(xì)胞互作。通過(guò)對(duì)腫瘤切除標(biāo)本進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)CD31+血管附近的FOLR2+巨噬細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞聚集體密切相關(guān)（圖6D）。FOLR2+巨噬細(xì)胞含量高的腫瘤中CD8+T細(xì)胞密度顯著高于FOLR2+巨噬細(xì)胞含量低的腫瘤（圖6E）。這些結(jié)果說(shuō)明基質(zhì)相關(guān)的FOLR2+巨噬細(xì)胞是腫瘤巢附近淋巴聚集體的結(jié)構(gòu)成分。
為了進(jìn)一步研究這兩種細(xì)胞類型是否能有效的結(jié)合，研究者對(duì)BC病變樣品進(jìn)行共聚焦實(shí)時(shí)成像，針對(duì)CD8、FOLR2、EPCAM來(lái)染色腫瘤病灶的CD8+T細(xì)胞、FOLR2+巨噬細(xì)胞和EPCAM+腫瘤細(xì)胞，隨后通過(guò)延時(shí)顯微鏡對(duì)細(xì)胞動(dòng)力學(xué)成像，發(fā)現(xiàn)CD8+T細(xì)胞降低了它們的速度并與FOLR2+巨噬細(xì)胞建立了長(zhǎng)期聯(lián)系，這與FOLR2缺失的腫瘤區(qū)域中CD8+T細(xì)胞的高流動(dòng)性形成了鮮明對(duì)比（圖6F）。這些結(jié)果揭示CD8+T細(xì)胞與FOLR2+巨噬細(xì)胞建立了長(zhǎng)期的相互作用，這一行為可能促進(jìn)T細(xì)胞的激活。與此結(jié)果一致，腫瘤全轉(zhuǎn)錄組中FOLR2表達(dá)與控制T細(xì)胞毒性功能的基因呈正相關(guān)，但與T細(xì)胞功能障礙的基因無(wú)關(guān)（圖6G）。總之，腫瘤浸潤(rùn)性CD8+T細(xì)胞主動(dòng)與FOLR2+巨噬細(xì)胞結(jié)合，這種相互作用與CD8+T細(xì)胞的激活和患者的生存呈正相關(guān)。

Fig.6 FOLR2+巨噬細(xì)胞在浸潤(rùn)腫瘤的CD8+T細(xì)胞中富集，并與淋巴聚集體共定位
7、FOLR2+巨噬細(xì)胞能夠響應(yīng)腫瘤生長(zhǎng)并獲得T細(xì)胞啟動(dòng)能力
為了解析FOLR2+巨噬細(xì)胞的功能特征，研究者利用bulk RNA測(cè)序技術(shù)來(lái)分析健康和中小型腫瘤小鼠乳腺中分離得到的FOLR2+巨噬細(xì)胞。主成分分析結(jié)果表明從乳腺腫瘤中分離的FOLR2+巨噬細(xì)胞以腫瘤大小依賴性方式改變其轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜（圖7A）。乳腺癌和健康小鼠FOLR2+巨噬細(xì)胞中有1356個(gè)差異表達(dá)基因（DEG），其中腫瘤的表達(dá)參與免疫系統(tǒng)正調(diào)節(jié)如B、T細(xì)胞趨化因子等、黏附分子、溶酶體蛋白基因。而健康小鼠則富含調(diào)節(jié)代謝過(guò)程的基因，說(shuō)明FOLR2+TRMs響應(yīng)腫瘤發(fā)展（圖7B和C）。為了測(cè)試乳腺癌FOLR2+和CADM1+巨噬細(xì)胞是促炎性（M1）還是抗炎性（M2）巨噬細(xì)胞，分析了這兩個(gè)細(xì)胞群M1或M2特征基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)細(xì)胞群均表達(dá)M1或M2的部分基因，說(shuō)明腫瘤微環(huán)境中巨噬細(xì)胞激活不符合體外M1/M2極化模型（圖7D）�？乖�特異性T細(xì)胞啟動(dòng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)FOLR2+巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的誘導(dǎo)初始T細(xì)胞激活、擴(kuò)增、多功能性和細(xì)胞毒性的能力。此外，從健康MG中分離的FOLR2+巨噬細(xì)胞不能有效激活CD8+T細(xì)胞，而從乳腺癌中分離出來(lái)的FOLR2+巨噬細(xì)胞可以誘導(dǎo)T細(xì)胞擴(kuò)增和分化（圖7E和F）。這些結(jié)果證實(shí)了FOLR2+巨噬細(xì)胞在腫瘤發(fā)展過(guò)程中被激活，并獲得了激活CD8+T細(xì)胞的能力。綜上所述，研究者提供了FOLR2+巨噬細(xì)胞不像免疫抑制細(xì)胞的證據(jù)。相反，腫瘤相關(guān)的FOLR2+巨噬細(xì)胞是強(qiáng)大的抗原提呈細(xì)胞，具有觸發(fā)CD8+T細(xì)胞激活的功能。

Fig.7 FOLR2+巨噬細(xì)胞響應(yīng)腫瘤生長(zhǎng)并獲得啟動(dòng)T細(xì)胞的能力

主要結(jié)論

本研究鑒定到一種在健康乳腺和乳腺癌原發(fā)腫瘤中存在的FOLR2+組織駐留巨噬細(xì)胞群。

1. FOLR2+巨噬細(xì)胞位于腫瘤基質(zhì)的血管周圍區(qū)域，在那里它們與CD8+T細(xì)胞相互作用。
2. FOLR2+巨噬細(xì)胞在體外可有效激活效應(yīng)CD8+T細(xì)胞。
3. 腫瘤中FOLR2+巨噬細(xì)胞的密度與患者較好的生存期呈正相關(guān)。

綜上所述，研究者揭示了腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞亞群的特定作用，并為在基于巨噬細(xì)胞的癌癥治療研究中的亞群靶向治療干預(yù)思路鋪平了道路。

參考文獻(xiàn)
Nalio Ramos, Rodrigo et al.“Tissue-resident FOLR2+ macrophages associate with CD8+ T cell infiltration in human breast cancer.”Cell vol. 185,7 (2022): 1189-1207.e25.