Ficoll密度梯度離心法分離PBMC

瀏覽次數(shù)：3198　發(fā)布日期：2022-6-22　來(lái)源：匯智和源

外周血單個(gè)核細(xì)胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC），是指外周血中具有單個(gè)核的細(xì)胞，包括淋巴細(xì)胞（Lymphocyte）、單核細(xì)胞（Monocyte）、樹突狀細(xì)胞（DC）和其他少量細(xì)胞。

1 原理

單個(gè)核細(xì)胞的體積、形態(tài)和比重與外周血其它細(xì)胞不同，紅細(xì)胞和多核白細(xì)胞的比重超過(guò)1.080，單個(gè)核細(xì)胞的比重為1.070左右，血小板為1.030左右。因此，可利用各種血細(xì)胞和單個(gè)核細(xì)胞比重之間的差異將各種血細(xì)胞與單個(gè)核細(xì)胞分離開來(lái)。

Ficoll密度梯度離心法是分離、純化PBMC最常用的方法。Ficoll是蔗糖的多聚體，中性，平均分子量400000，當(dāng)密度為1.2g/mL，未超出正常生理性滲透壓，也不穿過(guò)生物膜，故常用作PBMC分離的分離液。紅細(xì)胞、粒細(xì)胞比重大，離心后沉于管底；淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的比重小于或等于分離液比重，離心后漂浮于分離液的液面上，也可有少部分細(xì)胞懸浮在分離液中。吸取分層液液面上的白膜層細(xì)胞，并進(jìn)行適當(dāng)?shù)那逑矗涂蓮耐庵苎蟹蛛x到較高純度的單個(gè)核細(xì)胞，即PBMC。

2 方法

1）取新鮮抗凝全血，按照1：1比例加入1×稀釋洗滌液，將血液進(jìn)行稀釋（以降低血液粘稠度），輕柔混勻，備用。

2）向無(wú)菌離心管內(nèi)加入適量的單個(gè)核細(xì)胞分離液，將稀釋后的血樣平鋪到分離液液面上方（分離液：稀釋全血=1：2），保持兩液面界面清晰。

3） 800g，室溫，離心 20min-30min（注：設(shè)置較慢的加速度和減速度，如果有十檔，設(shè)為第三檔）。

4）離心結(jié)束后，吸棄血漿層，小心吸取PBMC層（即白膜層）并轉(zhuǎn)移至15mL離心管中。離心結(jié)束后，管內(nèi)液面從上至下依次為稀釋血漿層、PBMC層、分離液層和紅細(xì)胞層（見(jiàn)圖1）。