干細胞成骨、成脂、成軟骨三系分化 的操作方法
成骨誘導分化步驟
1.接種骨髓間充質干細胞：取對數生長期的細胞，按照2×104cells/cm2的細胞密度接種至包被后的培養(yǎng)器皿中，于37℃，5% CO2培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)至匯合度60-70%，棄掉上清，加入成骨誘導分化培養(yǎng)基。
2.細胞分化誘導：每2-3天更換成骨誘導培養(yǎng)基，于37℃，5%CO2培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)約14-21天，并注意觀察細胞形態(tài)變化。根據細胞鈣鹽結晶析出和鈣質結節(jié)形成的情況，決定終止細胞誘導的時間，進行染色鑒定。
4.茜素紅染色：加入適量茜素紅染液染3~5min，吸去茜素紅染液，用1×PBS清洗兩次，并加入適量1×PBS避免細胞干燥。
5.誘導評估：顯微鏡下觀察成骨染色效果，并進行圖像采集和誘導評估。誘導成功時，鈣質結節(jié)會與茜素紅染料結合后呈現紅色或橘紅色。
成脂誘導分化步驟
1.接種骨髓間充質干細胞：取對數生長期的細胞，按照2×104cells/cm2的細胞密度接種至包被后的培養(yǎng)器皿中，于37℃，5% CO2培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)至匯合度90-100%，棄掉上清，加入成脂誘導分化培養(yǎng)基誘導液。
2.細胞分化誘導：于37℃，5%CO２培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)約3天，更換為成脂誘導分化培養(yǎng)基誘導液，培養(yǎng)1天后，再更換為成脂誘導分化培養(yǎng)基維持液，繼續(xù)培養(yǎng)3天。
按照以上換液頻率誘導14-21天，并注意觀察細胞形態(tài)變化。根據細胞誘導形成的脂滴數量和大小，決定終止細胞誘導的時間，并進行染色鑒定。
3.細胞固定：吸去培養(yǎng)基,使用適量1×PBS清洗一次，棄去后取適量4%中性甲醛溶液覆蓋培養(yǎng)器皿底面，室溫固定30-60min，棄去固定液再使用1×PBS清洗兩次。
4.油紅O染色：取生理鹽水或1×PBS與油紅O原液配制油紅O工作液（油紅O原液: 生理鹽水=3:2），現用現配。向清洗干凈的誘導孔內加入適量工作液，靜置染色30min；吸走油紅O工作液，用1×PBS清洗兩次，并加入適量1×PBS避免細胞干燥。
5.誘導評估：顯微鏡下觀察成脂染色效果，并進行圖像采集和誘導評估；誘導成功時，脂滴會與油紅O染料結合后呈現紅色或橘紅色。
成軟骨平面誘導分化步驟
1.將對數生長期的細胞消化下來計數，成軟骨誘導分化培養(yǎng)基細胞重懸細胞，離心后調整細胞密度密度1-2.0×107cells/mL。
2.20μL懸滴到24孔板中央。（20μL含有4×105細胞）。37℃培養(yǎng)3h使細胞貼壁。
3.補充200uL誘導分化培養(yǎng)基正常培養(yǎng)，每隔2-3天換液一次。按照以上換液頻率誘導21-28天，并注意觀察細胞形態(tài)變化。
4.細胞固定：吸去培養(yǎng)基使用適量1×PBS清洗一次，棄去后取適量4%中性甲醛溶液覆蓋培養(yǎng)器皿底面，室溫固定30-60min，棄去固定液再使用1×PBS清洗兩次。
5.阿利新藍染色：向清洗干凈的誘導孔內加入適量染色液，避光靜置染色30min。吸去阿利新藍染色液，用1×PBS清洗兩次，并加入適量1×PBS避免細胞干燥。
6.誘導評估：顯微鏡下觀察成軟骨染色效果，并進行圖像采集和誘導評估。誘導成功時，軟骨組織中的內酸性粘多糖可被阿利辛藍染成藍綠色。
NOTE:間充質干細胞的成軟骨分化水平因細胞類型、細胞供體來源、培養(yǎng)條件、細胞代次、細胞狀態(tài)和分化時間等因素而異。
成軟骨三維誘導分化步驟
棄上清，加入0.5mL成軟骨誘導分化培養(yǎng)基基礎液，重懸細胞，150g離心5min。小心棄去上清，加入0.5mL成軟骨誘導分化培養(yǎng)基誘導液，重懸細胞，150g離心5min。
將15mL離心管的管蓋稍稍旋開，放置于37℃，5% CO2培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)。
2.細胞分化誘導:24h后觀察細胞沉淀形變團聚的情況，如有明顯的變化，則小心輕柔地撥動管底，嘗試讓細胞團脫離管底，全部浸潤在誘導液中。
置于37℃，5%CO2培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)約21天，通常每2天更換一次新鮮配制的成軟骨誘導分化培養(yǎng)基誘導液。注意觀察細胞團成球情況及表面光滑度，決定終止細胞誘導的時間，并進行染色鑒定。
3.染色鑒定
a)軟骨球固定：將軟骨球從離心管中轉移至EP管，并使用1×PBS清洗兩次，最后置于適量的4%中性甲醛溶液中。
b)石蠟包埋切片：軟骨球經石蠟包埋后切片。
c)阿利辛藍染色：將石蠟切片脫蠟，使用阿利辛藍染液染色30min，用自來水流水沖洗2min，蒸餾水沖洗1次。
d)誘導評估：顯微鏡下觀察成軟骨染色效果，并進行圖像采集和誘導評估。誘導成功時，軟骨組織中的內酸性粘多糖可被阿利辛藍染成藍綠色。
NOTE: 間充質干細胞的成軟骨分化水平因細胞類型、細胞供體來源、培養(yǎng)條件、細胞代次、細胞狀態(tài)和分化時間等因素而異。
