Genizer脂質(zhì)體擠出儀在類細胞微囊泡（mCVTs）制備中的應用
關鍵詞：類細胞微囊泡、基因遞送、細胞轉(zhuǎn)染、難轉(zhuǎn)染細胞的新型基因遞送技術。
新加坡國立大學研究團隊在本研究中，介紹了一種新型的基于微細胞囊泡技術 ( micro Cell Vesicle Technology mCVT)的嵌合型基因遞送平臺系統(tǒng)。這種基因遞送平臺系統(tǒng)由細胞膜和陽離子脂質(zhì)融合而成，被用于提高難轉(zhuǎn)染（hard-to-transfect HTT）細胞的轉(zhuǎn)染效率。微細胞囊泡的細胞膜成分賦予整個復合體胞吞特異性，減少了轉(zhuǎn)染過程中的復合體細胞毒性，而陽離子脂質(zhì)負責與遺傳物質(zhì)相結(jié)合，同時為mCVTs提供了結(jié)構完整性。
圖1 利用類細胞微囊泡技術進行難轉(zhuǎn)染細胞的轉(zhuǎn)染過程示意
背景
基因遞送是將外來DNA引入真核細胞的過程。如在基礎研究（如藥物發(fā)現(xiàn)和功能蛋白的機理研究）和臨床應用（如基因治療）中傳遞治療性或功能性基因以改變細胞過程。有效的基因轉(zhuǎn)染不僅需要成功地將外來核酸引入細胞，而且還需要它們隨后在細胞中的轉(zhuǎn)運和表達。這是一項具有挑戰(zhàn)性的任務，因為DNA分子本身是帶負電荷，因此在其常規(guī)形式下很難被細胞內(nèi)化。因此，人們對開發(fā)有效的基因傳遞系統(tǒng)產(chǎn)生了極大的興趣。在過去的幾十年里，人們探索了大量的載體系統(tǒng)，從基于病毒的遞送系統(tǒng)到非病毒載體。盡管非病毒基因遞送載體的轉(zhuǎn)染效率相對較低，但在安全性和臨床接受度方面有望成為首選，其中陽離子脂質(zhì)系統(tǒng)和基于聚合物的平臺是主要的例子。表1總結(jié)了目前常用的轉(zhuǎn)染試劑或方法的主要優(yōu)缺點。
表1 目前主要轉(zhuǎn)染試劑/方法的優(yōu)缺點
理想的非病毒基因遞送系統(tǒng)應能有效地將所需的DNA分子遞送到特定的細胞類型中，且細胞毒性最小，以確保目標基因的最大表達。然而，據(jù)我們所知，目前市售的轉(zhuǎn)染試劑明顯達不到這些標準，特別是當它們被用于轉(zhuǎn)染難轉(zhuǎn)染（HTT）細胞時。
表2 常用轉(zhuǎn)染試劑與方法對HTT細胞的轉(zhuǎn)染效率
HTT細胞通常包括原代細胞、胚胎干細胞和一些永生化細胞系，如3T3-L1（小鼠前脂肪細胞）、U937（人單核細胞）、Jurkat（人T淋巴細胞）、HUVEC（人臍靜脈內(nèi)皮細胞）等。據(jù)統(tǒng)計使用市售試劑對HTT細胞進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的效率經(jīng)常不超過25%。HTT細胞對外來物質(zhì)和質(zhì)粒的吸收率低的原因之一是其代謝活性低。此外，這些細胞通常對所使用的轉(zhuǎn)染試劑引起的細胞擾動非常敏感，有可能導致細胞毒性，最終導致細胞死亡。
最近，鑒于細胞來源的遞送系統(tǒng)有可能在一定程度上特異性地將活性貨物分子遞送到目標部位，因此獲得了相當?shù)年P注。事實上，許多研究已經(jīng)探索了使用單核細胞衍生的藥物遞送系統(tǒng)（DDS）來定向遞送化療藥物和質(zhì)粒DNA（pDNA）到腫瘤，或者使用紅細胞衍生的DDS來延長血液循環(huán)和定向遞送pDNA到血細胞中。據(jù)推測，保留母體細胞的細胞膜成分將賦予這些基于細胞的藥物遞送系統(tǒng)識別特定目標細胞的能力，可能通過逃避身體免疫系統(tǒng)的識別能力來促進。
盡管有重大的治療意義，但迄今為止，基于細胞的DDS在基因傳遞方面的全部潛力在很大程度上仍未得到開發(fā)。需要解決的關鍵挑戰(zhàn)包括細胞來源的DDS（如外泌體形式）的繁瑣和低通量分離/生產(chǎn)過程以及次優(yōu)的基因裝載/復合技術。因此，雖然這些系統(tǒng)在內(nèi)在的靶向性方面似乎很有優(yōu)勢，但它們在產(chǎn)量和pDNA裝載效率方面有很大的局限。因此，為了克服這些限制，我們在此提出開發(fā)一種新型的嵌合基因遞送系統(tǒng)，該系統(tǒng)由細胞膜成分和陽離子脂質(zhì)成分組成，前者用于增強靶細胞的內(nèi)化，后者用于增強pDNA的裝載。
在這項研究中，我們首次描述了微細胞囊泡技術（mCVTs）的發(fā)展，這是一種通過陽離子脂質(zhì)與細胞膜融合而獲得的新型混合遞送平臺。為了生產(chǎn)mCVTs，首先用低滲水溶液處理細胞來獲得鬼影細胞（CG無細胞質(zhì)于細胞器細胞），如Goh等人所描述的。低滲溶液在質(zhì)膜上形成短暫的開口，允許清除細胞內(nèi)的內(nèi)容物，同時保持質(zhì)膜的完整性。來自不同細胞懸浮在水介質(zhì)中的CG被用來水化干燥的DOTAP脂質(zhì)薄膜，隨后通過脂質(zhì)體擠出儀擠出，提供與擠出的DOTAP脂質(zhì)體相似的平均流體力學尺寸和Zeta電位的mCVTs。在這項研究中，我們證明了mCVTs能夠與質(zhì)粒復合并被目標細胞內(nèi)化，而且細胞毒性最小。有趣的是，當從不同細胞類型產(chǎn)生的mCVTs在體外進行比較時，對于mCVTs所來源的細胞類型，它們顯示出明顯更高的轉(zhuǎn)染效率。
圖2 mCVTs及其結(jié)構組件的示意圖
方法與結(jié)果
制備鬼影細胞（CG無細胞質(zhì)與細胞器細胞膜）以確保mCVTs的可重復性和安全狀況。方法與結(jié)果 略
mCVTs的生產(chǎn)和特征分析。
與脂質(zhì)體生產(chǎn)類似，脂質(zhì)薄膜法被用來生產(chǎn)mCVTs。DOTAP薄膜與CG水合，形成包裹CG的大型多分子脂質(zhì)體。這種懸浮液被擠出，來自CG的漿膜含有DOTAP脂質(zhì)（如圖3A所示）。按照我們小組以前建立的方法，證明在擠壓后，這樣產(chǎn)生的mCVTs由脂質(zhì)和CG膜的融合組成。一般來說，mCVT的大小分布與脂質(zhì)體相似。為了證明這種方法在各種細胞系中的穩(wěn)健性和通用性，使用來自不同細胞系的CG制作了mCVTs，如一些HTT細胞（即3T3-L1）和非癌細胞（即HEK293和RAW264.7）。如圖3B所示，各種mCVTs的流體力學尺寸和PDI通常在400納米的范圍內(nèi)（PDI∼0.4），與使用相同擠壓方法生產(chǎn)的DOTAP脂質(zhì)體（PDI∼0.2）類似。在圖3C中，不同的配方觀察到類似的zeta電位值（約+30 mV至+40 mV），表明這種方法普遍適用于從不同細胞系產(chǎn)生的CG。有趣的是，當mCVT3T3-L1與pDNA復配時，其大小分布與未復配的mCVTs相似，而整體zeta電位變?yōu)樨撝担@可能表明復配成功（因為帶負電的pDNA使帶正電的mCVTs中和）。
圖3 mCVTs的生產(chǎn)和表征
A. mCVTs的示意圖，涉及細胞鬼魂和水合薄膜制成的脂質(zhì)體的融合。B. 不同的mCVTs和帶有質(zhì)粒的mCVT3T3-L1的水動力尺寸與DOTAP脂質(zhì)體相比。所有mCVTs的尺寸都小于500納米。C. 與DOTAP脂質(zhì)體相比，不同的mCVTs和帶質(zhì)粒的mCVT3T3-L1的Zeta電位。所有mCVTs的Zeta電位都在+30 mV以上，除了帶有質(zhì)粒DNA（5 µg）的mCVT3T3-L1，由于與質(zhì)粒DNA的相互作用而顯示出負的Zeta電位。數(shù)據(jù)代表平均值 ± SD（n = 3）。
圖 原文中mCVTs制備與所用脂質(zhì)體擠出器描述
