非酒精性脂肪肝 (NAFLD)的特征為肝臟中脂滴沉積，但無明顯的酒精攝入和繼發(fā)性原因，現(xiàn)已被定義為代謝功能障礙相關(guān)的脂肪性肝病 (MAFLD)。MAFLD目前包括肝脂肪變性 (HS) 和非酒精性脂肪性肝炎 (NASH)，最終導(dǎo)致肝纖維化和肝硬化。MAFLD發(fā)病機制復(fù)雜，且與代謝綜合征、肥胖和 2 型糖尿病 (T2D) 密切相關(guān)。來自英國諾丁漢大學(xué)的科研團隊通過對MAFLD患者進行多組學(xué)分析，獲得了不同程度HS患者的特征，并通過綜合分析破譯了早期MAFLD的發(fā)病機制，相關(guān)成果發(fā)表于《Advanced Science》。

HS與臨床指標(biāo)✦

納入56名患有不同程度HS的超重和肥胖受試者(BMI>28.8kg·m-2)，排除攜帶PNPLA3 I148M (I148M為純合子)的患者。將受試者分為四個不同組：i) 10名無脂肪變性 (HS<5.5%)，ii) 14名輕度脂肪變性 (5.5%≤HS<8%)，iii) 20名中度脂肪變性 (8.0%≤HS<16.5%)，和iv) 12名重度脂肪變性 (HS≥16.5%)。通過測量臨床指標(biāo)對這些受試者進行表型分析。結(jié)果顯示，與無脂肪變性的受試者相比，重度和中度脂肪變性受試者的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、尿酸（尿酸鹽）和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（GGT）水平顯著升高，這些變量在輕度脂肪變性受試者中也呈現(xiàn)升高趨勢。同時發(fā)現(xiàn)，與無脂肪變性的受試者相比，重度脂肪變性受試者的臨床變量（包括白蛋白、肌酐、肌酸激酶等）顯著升高，且在輕度、中度受試者中也呈現(xiàn)升高趨勢�；�于上述臨床變量的主成分分析（PCA）結(jié)果顯示，無、輕度、中度和重度脂肪變性之間呈現(xiàn)明顯的分離趨勢。

▲圖1. HS與臨床和物理變量之間的關(guān)系

MAFLD患者腸道和口腔菌群失調(diào)✦

對唾液和糞便樣本進行宏基因組分析，獲得輕度、中度及重度脂肪酸變性組與無脂肪變性組間的口腔及腸道差異物種，并通過每個HS組與無脂肪變性組之間的Log2倍數(shù)變化 (Log2FC)對不同HS組間發(fā)生顯著變化的物種進行線性回歸分析。結(jié)果顯示，腸道菌群中的差異物種變化在輕度和中度脂肪變性組之間以及在中度和重度脂肪變性組之間呈現(xiàn)正相關(guān)，而在輕度和重度脂肪變性組之間呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，提示當(dāng)發(fā)展到重度脂肪變性階段時，腸道菌群組成存在較大差異。而口腔菌群中差異的物種在不同組之間均呈現(xiàn)正相關(guān)，表明不同組之間口腔菌群組成的變化相似。

基于腸道菌群差異分析結(jié)果表明，與無脂肪變性組相比，輕度脂肪變性組中Bacteroidetes、Proteobacteria、lenisphaela和Firmicutes4個門水平下的一些物種豐度顯著降低；，而中度脂肪變性組中Firmicutes和Bacteroidetes2個門水平的物種豐度顯著升高，只有Firmicutes bacterium CAG 95豐度顯著降低；重度脂肪變性組中Actinobacteria、Bacteroidetes、Lentisphaerae、Firmicutes和Proteobacteria這幾個門水平的物種豐度顯著降低；中度和重度脂肪變性組的Firmicutes bacterium CAG 95的豐度均顯著降低。

基于口腔菌群差異分析結(jié)果表明，與無脂肪變性組相比，輕度組中Firmicutes、Bacteroidetes和Actinobacteria這幾個門水平的一些物種豐度顯著降低；中度組中Firmicutes中的一些物種豐度升高，Proteobacteria中的一些物種豐度降低；重度脂肪變性組中Bacteroidetes和Proteobacteria中的一些物種豐度顯著降低，而Actinobacteria中的一些物種豐度顯著升高；中度和重度脂肪變性組中Haemophilus sputorum的豐度顯著降低。

隨著脂肪變性越來越嚴(yán)重，腸道菌群組成中Bacteroidia是富集程度最高的菌群，Clostridia是富集程度排名第二的菌群。與無脂肪變性組相比，重度脂肪變性組中Clostridia/Bacteroidia比值顯著降低，Firmicutes和Negativicutes的相對豐度降低， Negativicutes的豐度升高。

▲圖2. MAFLD患者腸道和口腔菌群失調(diào)

宏基因組數(shù)據(jù)與臨床指標(biāo)關(guān)聯(lián)分析✦

在中度和重度脂肪變性組中，腸道和口腔菌群的物種豐度與顯著改變的臨床變量之間的相關(guān)性分析顯示，存在明顯的物種豐度減少和增加的簇。且腸道菌群中Firmicutes豐度與HS、AST、ALT和尿酸水平呈顯著負(fù)相關(guān)。口腔菌群中Campylobacter concisus和Capnocytophaga granulosa的豐度與HS、ALT和AST水平呈負(fù)相關(guān)，而Eikenella sp NML130454和Actinomyces johnsonii則與以上指標(biāo)呈正相關(guān)，而Haemophilus與HS和ALT水平呈顯著負(fù)相關(guān)。

口腔菌群與腸道菌群的相關(guān)性分析結(jié)果表明，口腔菌群中Actinomyces sp ICM47的豐度與產(chǎn)丁酸菌Eubacterium rectale和Roseburia faecis呈負(fù)相關(guān)，而腸道菌群中的 Faecalibacterium prausnitzi和Roseburia gutis的豐度與口腔菌群中Prevotella sp oral taxon 306的豐度呈負(fù)相關(guān)；腸道菌群中Faecalibacterium prausnitzii的豐度與口腔菌群中Haemophilus parainfluenzae, Neisseria mucosa和Prevotella copri的豐度呈正相關(guān)。

▲圖3. 宏基因組學(xué)數(shù)據(jù)與臨床參數(shù)關(guān)聯(lián)分析

MAFLD患者血漿代謝組學(xué)變化✦

對56名受試者的血漿樣本進行非靶向代謝組學(xué)分析，共獲得928種代謝物，且與無脂肪變性組相比，輕度、中度和重度脂肪變性組中分別有43、79和129種代謝物存在顯著差異。在這些代謝物中，分別有17、52和66種與脂質(zhì)代謝有關(guān)，剩余26、27和63種代謝物與其他代謝通路有關(guān)（如氨基酸、NAD+和抗氧化代謝）。在這些非脂質(zhì)代謝物中，分別有16種、14種、43種代謝物存在特異性顯著差異。

同時發(fā)現(xiàn)，與無脂肪變性相比，血紅素的血漿水平僅在輕度脂肪變性組中顯著升高，據(jù)報道血紅素合成的改變可能與MAFLD的氧化應(yīng)激增加有關(guān)。還發(fā)現(xiàn)膽紅素的降解產(chǎn)物在重度脂肪變性組中顯著降低；可促進炎癥的N-乙酰犬尿氨酸僅在輕度組升高。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）合成的前體—喹啉酸，僅在中度脂肪變性組中顯著降低。據(jù)報道，喹啉酸的下調(diào)與動物的MAFLD有關(guān)，而NAD+的代謝改變與人類的MAFLD有關(guān)。還發(fā)現(xiàn)N，N，N-三甲基-5-氨基戊酸鹽（TMAVA）在中度脂肪變性組中顯著升高在組，而絲氨酸、N-乙酰甘氨酸及甘氨酸結(jié)合代謝物的水平僅在重度脂肪變性組中顯著降低。所有膽紅素降解產(chǎn)物僅在重度脂肪變性組中顯著降低。已報道重度脂肪變性組中膽紅素可以起到抗氧化劑的作用，減少HS的積累。另一方面，色氨酸、賴氨酸和尿酸代謝相關(guān)代謝物、尿酸和黃嘌呤在重度脂肪變性組中顯著升高；還發(fā)現(xiàn)與尿素循環(huán)相關(guān)的N，N，N-三甲基丙氨酰脯氨酸甜菜堿（TMAP）在重度脂肪變性組中顯著升高，這與之前的研究一致，即MAFLD患者的血漿尿酸水平與HS顯著相關(guān)。無脂肪變性組相比，重度和中度組中半胱氨酸-谷胱甘肽-二硫化物（一種谷胱甘肽和半胱氨酸結(jié)合物）水平顯著降低；三個脂肪變性組的血漿3-羥基異丁酸（3-HIB）、氧化半胱氨酸甘氨酸水平顯著升高，5,6-二氫尿嘧啶水平顯著降低。

▲圖4. MAFLD患者血漿代謝組學(xué)變化

血漿代謝物與表型關(guān)聯(lián)分析✦

對五個臨床指標(biāo)（包括肝臟脂肪、尿酸、ALT、AST和GGT）的血漿水平與代謝物血漿水平進行相關(guān)性分析， 結(jié)果表明，這些臨床變量與TMAP和BCAA及其結(jié)合物（包括亮氨酸、異亮氨酸、γ-谷氨酰亮氨酸、γ-谷氨酰異亮氨酸、γ-谷氨酰纈氨酸、3-甲基-2-氧代戊酸和N-乙酰肌肽）的血漿水平呈正相關(guān)。ALT、AST和GGT水平與血漿犬尿氨酸水平呈正相關(guān)。此外，血漿尿酸水平與這五個臨床指標(biāo)呈顯著正相關(guān)；而血漿半胱氨酸-谷胱甘肽-二硫化物水平與這五個臨床指標(biāo)呈顯著負(fù)相關(guān)。血漿17α-羥基孕烯醇酮3-硫酸鹽和5α-孕烯醇酮-3β，20α-單硫酸二醇水平與HS、ALT、AST和GGT水平呈顯著負(fù)相關(guān)。血漿代謝水平差異可用于提示HS，以及MAFLD患者的治療效果。

MAFLD患者血漿的炎癥蛋白質(zhì)組學(xué)變化✦

通過蛋白質(zhì)組分析平臺鄰位延伸分析（PEA）測量炎癥蛋白標(biāo)記物的血漿水平。結(jié)果顯示，與非脂肪變性組相比，CDCP1的血漿水平在輕度脂肪變性組顯著降低，在重度脂肪變性組顯著升高，而其他大多數(shù)蛋白質(zhì)在所有脂肪變性組中的變化趨勢一致。且TNFRSF9血漿水平在三個脂肪變性組均顯著降低；ST1A1、IFN-γ和CCL23水平僅在輕度脂肪變性組降低。CX3CL1、TNF、CD40、CSF-1和TWEAK水平在中度脂肪變性組中降低；NT-3、CCL20、CCL4、CCL3、LIF-R、OPG和HGF僅在重度脂肪變性組中升高，而SCF僅在重度脂肪變性組中降低。然后對五個臨床指標(biāo)與炎癥相關(guān)蛋白血漿水平的進行相關(guān)性分析，確定了兩個主要簇，這些臨床指標(biāo)分別與第一和第二簇中至少一種炎癥相關(guān)蛋白呈負(fù)相關(guān)和正相關(guān)。

▲圖5. 血漿代謝組與患者表型關(guān)系及患者血漿的炎癥蛋白質(zhì)組學(xué)變化

基于多組學(xué)數(shù)據(jù)的HS預(yù)測✦

通過表型組學(xué)、代謝組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和口腔/腸道宏基因組學(xué)數(shù)據(jù)分析，確定了在56名受試者中具有區(qū)分不同HS程度組間的差異特征。對單組/多組數(shù)據(jù)進行隨機森林算法分析發(fā)現(xiàn)與HS相關(guān)的關(guān)鍵特征。首先，通過單一組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，腸道宏基因組數(shù)據(jù)是預(yù)測脂肪變性程度的最佳數(shù)據(jù)集，準(zhǔn)確率> 70%（曲線下面積（AUC）：0.90）。而炎癥蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)的預(yù)測效能最差，準(zhǔn)確率僅為35.3%（AUC：0.72）。接下來，測試了單一組學(xué)數(shù)據(jù)集中的前五或前十個特征，并嘗試進行不同組合，結(jié)果顯示臨床指標(biāo)（五個變量）、代謝組學(xué)（十個變量）和蛋白質(zhì)組學(xué)（五個變量）中的各種重要特征產(chǎn)生了64.7%的準(zhǔn)確率（AUC:0.92），而添加腸道和口腔宏基因組學(xué)（各十個重要特征）后，在預(yù)測脂肪變性程度方面的最高準(zhǔn)確率為94.1%（AUC:0.951）。并在22名受試者的隨訪隊列中進行驗證，通過添加臨床指標(biāo)（五個變量）、代謝組學(xué)（十個變量）、蛋白質(zhì)組學(xué)（五個變量）以及腸道和口腔宏基因組學(xué)（各十個重要特征）中的重要特征，模型準(zhǔn)確率達到82.7%（AUC:0.843）。通過在發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)集中添加臨床、代謝組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、腸道宏基因組學(xué)和口腔宏基因組學(xué)數(shù)據(jù)中的前五大特征，對HS的預(yù)測效能最高（AUC:1.0）。且在隨訪隊列進行了驗證獲得了更高的預(yù)測效能（AUC：0.886）。

臨床指標(biāo)（ALT、AST、uric acid、insulin和 GGT）、代謝組學(xué)（N,N-二甲基-5-氨基戊酸、5-（半乳糖基羥基）-L-賴氨酸、酚葡糖苷酸、N,N-二甲基丙氨酸 和 N-甲基�；撬幔�、蛋白質(zhì)組學(xué)（CDCP1、CD244、LIF-R、FGF-21和CXCL9）、腸道宏基因組學(xué)（Barnesiella intestinihominis、Dorea longicatena、Prevotella sp CAG 279, Roseburia intestinalis和Ruminococcus bromii）和口腔宏基因組學(xué)（Actinomyces naeslundii, Veillonella infantium,Treponema vincentii, Campylobacter showae和Campylobacter concisus）中用于預(yù)測HS的前五大特征可被視為MAFLD的候選生物標(biāo)記物。在本研究中，還發(fā)現(xiàn)腸道中的Barnesiella intestinihominis、Dorea longicatena和Ruminococcus bromii和口腔中的Campylobacter concisus和Veillonella infantium的豐度與HS顯著相關(guān)，且其豐度與血漿代謝物水平和炎癥蛋白質(zhì)組學(xué)水平顯著相關(guān)。

隨后生成一個綜合多組學(xué)網(wǎng)絡(luò)，用于顯示其他組學(xué)數(shù)據(jù)集內(nèi)和其他組學(xué)數(shù)據(jù)集間的不同分析物之間的關(guān)系。對來自上述組學(xué)數(shù)據(jù)的所有分析物之間，通過FDR<0.05的邊緣過濾，產(chǎn)生一個具有1032個節(jié)點和17536個邊（3.3%網(wǎng)絡(luò)密度）的相對稀疏網(wǎng)絡(luò)。對網(wǎng)絡(luò)進行中心性分析發(fā)現(xiàn)，前20個連接最多的節(jié)點與脂質(zhì)代謝有關(guān)，例如神經(jīng)酰胺、鞘磷脂、甘油二酯和磷脂相關(guān)的子通路。同時發(fā)現(xiàn)與脂質(zhì)相關(guān)的臨床變量是臨床變量（總膽固醇、GGT、LDL和TG水平）的最重要節(jié)點。

▲圖6. 基于多組學(xué)數(shù)據(jù)的HS預(yù)測

多組學(xué)數(shù)據(jù)生物網(wǎng)絡(luò)的綜合分析✦

通過Spearman相關(guān)性進行綜合多組學(xué)網(wǎng)絡(luò)分析以探究多組學(xué)數(shù)據(jù)集內(nèi)部及數(shù)據(jù)集之間的重要聯(lián)系。對網(wǎng)絡(luò)進行中心性分析發(fā)現(xiàn)，前20個連接最多的節(jié)點與脂質(zhì)代謝有關(guān)，例如神經(jīng)酰胺、鞘磷脂、甘油二酯和磷脂相關(guān)的通路；與脂質(zhì)相關(guān)的臨床變量是臨床變量的最重要節(jié)點。與細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用相關(guān)的 STAMBP、TNFSF14、SIRT2、CXCL5、CXCL1和CD40，以及與多個信號通路相關(guān)的NF-kappa B、TNF 和 IL-17是炎癥蛋白質(zhì)組學(xué)中的最重要節(jié)點。隨后進行聚類分析獲得4個簇。在簇-0 中，與氨基酸代謝相關(guān)的代謝物位于首位；而簇-1以磷脂、碳水化合物和�；撬岽�謝為主；在簇-2中，包含大多數(shù)與脂質(zhì)相關(guān)的代謝物和臨床變量，使該簇成為HS中的候選中心變量；簇-3主要與脂肪酸代謝相關(guān)。

從多組學(xué)隨機森林模型中提取特征并僅篩選顯著改變的分析物，從而最終獲得九種重要特征：ALT、AST、GGT、尿酸、CDCP1、LIF-R、Dorea longicatena (腸道)、Ruminococcus bromii (腸道），Porphyromonas endodontalis（口腔）。通過檢索這些特征的第一相鄰特征以及HS的子網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果表明，其主要集中于脂質(zhì)代謝物、γ-谷氨酰氨基酸、BCAA 代謝物、脂肪酸代謝（肉堿衍生物）和與HS顯著相關(guān)的谷胱甘肽相關(guān)代謝物。

構(gòu)建一個以宏基因組學(xué)為中心的網(wǎng)絡(luò)，包括來自隨機森林分析的關(guān)鍵特征，以及至少五個樣本中豐度>1%的所有菌群物種。與之前的方法類似，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HS與腸道菌群中的Victivallis vadensis、Firmicutes bacterium CAG 95、Slackia isoflavoniconvertens和Bilophila wadsworthia以及口腔菌群中Porphyromonas endodontalis和Haemophilus sputorum的豐度呈顯著負(fù)相關(guān)。而腸道中Slackia isoflavoniconvertens和Bilophila wadsworthia的豐度也與HS、AST和GGT水平呈負(fù)相關(guān)。腸道中的Streptococcus salivarius的豐度與 ALT、AST 和 GGT 水平呈負(fù)相關(guān)。另一方面，Dorea longicatena的豐度與ALT和 AST水平呈負(fù)相關(guān)，與Bacteroidales和Clostridiales呈正相關(guān)�？傊�，多組學(xué)數(shù)據(jù)的綜合網(wǎng)絡(luò)分析強化了單一組學(xué)分析的結(jié)果，并增加了識別與HS相關(guān)的關(guān)鍵特征的能力。此外，它揭示了不同組學(xué)數(shù)據(jù)內(nèi)部和數(shù)據(jù)之間的功能關(guān)系。

▲圖7. 多組學(xué)數(shù)據(jù)生物網(wǎng)絡(luò)的綜合分析

小結(jié)✦

本研究通過對不同程度肝脂肪變性（HS）的MAFLD患者進行多組學(xué)分析，鑒定出與肝脂肪變性相關(guān)的口腔和腸道菌群失調(diào)特征，揭示基于全身代謝和炎癥過程的宿主-微生物群相互作用。并通過網(wǎng)絡(luò)分析對多組學(xué)數(shù)據(jù)進行整合，確定HS的關(guān)鍵特征，基于這些特征構(gòu)建診斷模型，并在隨訪隊列進行驗證。

參考文獻✦

Multiomics Analysis Reveals the Impact of Microbiota on Host Metabolism in Hepatic Steatosis. Advanced Science. 2022.

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