已知蛋白質(zhì)組的動(dòng)態(tài)可塑性是植物快速適應(yīng)環(huán)境變化的重要機(jī)制之一，植物中廣泛存在的蛋白-泛素酶體調(diào)控了蛋白質(zhì)的降解，而翻譯后修飾則是影響蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的關(guān)鍵決定因素。最普遍的修飾之一是N末端的乙�；�修飾（NTA），該修飾由N乙酰轉(zhuǎn)移酶A（NatA）催化完成，但翻譯后修飾如何調(diào)控蛋白的穩(wěn)定性仍有許多未知。

2022年2月10日，Nature Communications (IF 14.919)發(fā)表了一篇題為“Cotranslational N-degron masking by acetylation promotes proteome stability in plants”的文章，該文章采用泛素化蛋白組學(xué)和蛋白組學(xué)的方法發(fā)現(xiàn)依賴于NatA的NTA損傷會(huì)導(dǎo)致擬南芥蛋白質(zhì)組的整體不穩(wěn)定，并發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的degron，該degron標(biāo)記了大多數(shù)非乙�；�的胞質(zhì)蛋白并可通過泛素系統(tǒng)降解。

研究材料
擬南芥葉片

技術(shù)路線
· 步驟1：NatA的缺失增強(qiáng)了蛋白的降解；
· 步驟2：在NatA缺失的植物中，發(fā)生降解的蛋白質(zhì)主要是NatA底物；
· 步驟3：在NatA缺失的植物中，胞質(zhì)NatA底物是不穩(wěn)定的；
· 步驟4：在NatA缺失的植物中，增強(qiáng)的蛋白質(zhì)降解被翻譯的增加所抵消；
· 步驟5：植物中NatA底物的nonAc-X²/N-degron的鑒定。

研究結(jié)果
1. NatA的缺失增強(qiáng)了蛋白的降解
NatA由具有催化活性的亞基NAA10和核糖體錨定的亞基NAA15組成，通過對(duì)亞基的敲除，證明NatA的缺失導(dǎo)致了蛋白降解速度增加4倍（圖1a）且蛋白酶體活性增加（圖1b）、泛素化蛋白增多（圖1c）。結(jié)果說明NatA的缺失是通過提高內(nèi)源性泛素化率和增加蛋白酶體的容量導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解速度增快的。

圖1 NatA的缺失會(huì)通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)影響蛋白的降解

2. 在NatA缺失的植物中，發(fā)生降解的蛋白質(zhì)主要是NatA底物

對(duì)泛素化蛋白進(jìn)行富集并進(jìn)行蛋白組學(xué)分析，結(jié)果表明232個(gè)蛋白屬于顯著差異泛素化蛋白，且其中的162個(gè)蛋白屬于NatA的底物（圖1g）。GO分析發(fā)現(xiàn)在NatA缺失的植物中，泛素化蛋白主要是胞質(zhì)蛋白(232個(gè)蛋白中有141個(gè))，它們參與了不同的脅迫響應(yīng)和蛋白質(zhì)折疊(表1)。
 

表1 泛素化蛋白組學(xué)GO分析結(jié)果

3. 在NatA缺失的植物中，胞質(zhì)NatA底物是不穩(wěn)定的
盡管UPS誘導(dǎo)了NatA底物的降解，但NatA損失的植物葉片中的總蛋白含量不受影響(圖2a)。對(duì)穩(wěn)態(tài)蛋白質(zhì)的蛋白組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)在鑒定到的1238個(gè)蛋白中僅92個(gè)蛋白在NatA缺失的植物中發(fā)生了顯著變化，然而83%的低穩(wěn)態(tài)蛋白均為NatA的底物（圖2b）。隨后作者選取顯著下調(diào)的^ARKGR1和非顯著上調(diào)的^ASROAS-TL A（兩者均為NatA的底物）進(jìn)行后續(xù)驗(yàn)證，追蹤（蛋白穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)）結(jié)果顯示雖^ARKGR1和^ASROAS-TL A在NatA損失的植物中均顯著降解（圖2c），但加入蛋白酶體抑制劑MG132后，^ASROAS-TL A隨即在NatA損失的植物中顯著的快速累積（圖2e），意味著不穩(wěn)定的^ASROAS-TL A未受影響的穩(wěn)態(tài)水平是由于其受翻譯增強(qiáng)的結(jié)果。而^ARKGR1不受增強(qiáng)的翻譯水平的影響（圖2e）。非NatA的底物^MPPSAT5和^MRETUBB4的穩(wěn)定性不受影響（圖2d和2e）。

圖2 NatA的缺失不影響整體的蛋白水平，但選擇性顯著影響其底物

4. 在NatA缺失的植物中，增強(qiáng)的蛋白質(zhì)降解被翻譯的增加所抵消
實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在NatA缺失的植物中，其翻譯水平較正常組織提高了4倍（圖3a），這是由于其對(duì)多種蛋白質(zhì)的選擇性翻譯增強(qiáng)導(dǎo)致的（圖3b）。而這種翻譯增強(qiáng)是通過影響TOR蛋白（核糖體數(shù)量的主要調(diào)控蛋白）的活性引起的（圖3c和3d）。為尋找新翻譯的蛋白，作者進(jìn)行了蛋白組學(xué)分析(共鑒定到913個(gè)蛋白)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)新翻譯的蛋白大多為NatA的底物（圖3g）。泛素化蛋白組學(xué)和新翻譯蛋白的蛋白組學(xué)的結(jié)果進(jìn)一步表明了由于N乙酰化水平受損所導(dǎo)致的NatA底物的選擇性失穩(wěn)被其翻譯增強(qiáng)所抵消從而維持蛋白的穩(wěn)態(tài)水平。

圖3 NatA缺失的植株中表現(xiàn)出較高的NatA底物翻譯率

5. 植物中NatA底物的nonAc-X²/N-degron的鑒定
為驗(yàn)證NatA底物NTA的降低會(huì)增強(qiáng)蛋白的周轉(zhuǎn)，作者對(duì)NatA底物（^ASROAS-TL A）和非NatA底物的半衰期進(jìn)行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)NatA缺失植物中OAS-TL A的半衰期比正常植物中的顯著變短（圖4a），而非NatA底物的半衰期未發(fā)生變化（圖4b和4c）。為驗(yàn)證位置2的Ala是引起蛋白不穩(wěn)定的原因，作者構(gòu)建了^APSOASTL A，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)^APSOASTL A在正常植物中的半衰期與NatA缺失植物中^ASROAS-TL A的半衰期一致，證明了Ala2中NTA的缺失導(dǎo)致了植物中OAS-TL A的不穩(wěn)定。由此作者發(fā)現(xiàn)了不穩(wěn)定信號(hào)并將其命名為nonAc-X²/N-degron。10個(gè)NatA底物蛋白進(jìn)行了驗(yàn)證（圖4d），結(jié)果表明NTA的缺失是蛋白質(zhì)相對(duì)半衰期降低的原因。

圖4 NatA缺失植物中蛋白質(zhì)半衰期的測(cè)定

小編小結(jié)
本研究發(fā)現(xiàn)在擬南芥中，NatA活性的減少會(huì)導(dǎo)致泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的蛋白質(zhì)降解速度增加4倍。同時(shí)通過增強(qiáng)TOR的活性增加了NatA底物蛋白的翻譯，這意味著NTA缺失觸發(fā)了反饋機(jī)制，以維持穩(wěn)定的蛋白質(zhì)豐度。蛋白質(zhì)組、翻譯組和泛素組的定量分析表明，NatA底物響應(yīng)了NTA缺失引起的降解和翻譯增加。一項(xiàng)針對(duì)NTA底物穩(wěn)定性的靶向分析發(fā)現(xiàn)，NTA缺失通過一種以前未描述的、廣泛保守的nonAc/N-degron在植物中引發(fā)蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定。因此，帶有乙�；瘶�(biāo)記的蛋白質(zhì)對(duì)于協(xié)調(diào)蛋白質(zhì)組的穩(wěn)定性至關(guān)重要。

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