真菌組是腸道微生物組中不可忽視的成員，在包括炎癥性腸病（IBD）在內(nèi)的多種疾病中，都發(fā)現(xiàn)了腸道真菌組成的變化。然而，真菌組對宿主健康的影響及其作用機制我們?nèi)匀恢�之甚少�?022年3月美國康奈爾大學(xué)Iliev教授等人繼于Cell期刊上發(fā)表“黏膜真菌通過17型免疫促進腸道屏障功能和社會行為”的研究成果后，再次于Top學(xué)術(shù)期刊Nature（IF 49.962）上發(fā)表題為“Immune regulation by fungal strain diversity in inflammatory bowel disease”的文章，該研究通過對黏膜真菌多樣性測序、培養(yǎng)組學(xué)、全基因組測序和免疫反應(yīng)檢測等實驗，揭示了潰瘍性結(jié)腸炎（UC）患者腸道黏膜中優(yōu)勢真菌-白色念珠菌（Ca）的菌株多樣性及其對宿主腸道免疫調(diào)控的機制和菌株特異性，為研究IBD的疾病機理和治療方法提供了新視角。

研究材料

結(jié)腸黏膜的灌洗液、C57BL/6J小鼠（SPF、GF）、Ca標準菌株和分離株

技術(shù)路線

· 步驟1：真菌多樣性測序發(fā)現(xiàn)UC患者的結(jié)腸黏膜中Ca豐度明顯增加；

· 步驟2：真菌培養(yǎng)組學(xué)結(jié)合全基因組測序表明，人腸道Ca具有高菌株多樣性，其對免疫細胞的破壞力以及在小鼠腸道中誘導(dǎo)Th17和促炎免疫的能力具有菌株特異性；

· 步驟3：機制上，高免疫細胞破壞力（HD）的Ca菌株通過分泌念珠菌素（受Efg1-Ece1調(diào)控）促進腸道炎癥，且該作用依賴于IL-1β，阻斷其受體IL-1R可在小鼠中減輕疾�。�

· 步驟4：患者的Ca菌株誘導(dǎo)免疫細胞損傷和IL-1β表達的能力可反映患者疾病嚴重程度。
 

研究結(jié)果

1. 發(fā)炎腸道中Ca相對豐度大幅增加

對Non-IBD（n=38）和UC患者（n=40）的結(jié)腸黏膜灌洗液樣本進行ITS擴增子測序，結(jié)果顯示兩組間真菌組成存在顯著差異（圖1a）。其中，念珠菌屬和酵母菌屬為優(yōu)勢屬，與Non-IBD組相比，UC患者黏膜富集的真菌群中念珠菌屬增加，而酵母菌屬則顯著減少（圖1b、c）。培養(yǎng)依賴性實驗顯示Ca在UC 患者的黏膜中顯著增加（圖1d）。作者對C57BL/6小鼠進行白色念珠菌SC5314菌株口服灌胃，使用DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎并結(jié)合皮質(zhì)類固醇治療，來研究Ca定植對腸道炎癥的影響。結(jié)果顯示對照組小鼠僅發(fā)展為輕度疾病，但Ca定殖的小鼠表現(xiàn)出增強的組織病理學(xué)，包括結(jié)腸中黏膜糜爛、隱窩破壞和炎癥細胞浸潤增加，以及CD4⁺ T細胞和中性粒細胞浸潤增加（圖1e-h）。這些結(jié)果表明共生的Ca對皮質(zhì)類固醇治療下的疾病結(jié)果產(chǎn)生負面影響。

圖1 Ca在UC患者的結(jié)腸粘膜中擴張，并在小鼠結(jié)腸炎模型中促進炎癥

 

2. Ca菌株特征影響腸道免疫

腸巨噬細胞是啟動和誘導(dǎo)結(jié)腸粘膜抗真菌免疫的關(guān)鍵，強毒性Ca菌株則可以損傷這些細胞，而Ca的菌絲形態(tài)發(fā)生程序是在幾種粘膜表面產(chǎn)生毒力因子和發(fā)病機制的關(guān)鍵。培養(yǎng)組學(xué)實驗結(jié)果顯示腸道Ca分離株可分為兩大類：高損傷 (HD-Ca) 和低損傷分離株（LD-Ca），~60%的分離株無論宿主疾病狀態(tài)如何都形成細絲，且形成細絲的Ca菌株對巨噬細胞的損傷更大（圖2a、b）。這些結(jié)果表明Ca菌株損傷免疫細胞的能力與成絲能力相關(guān)。通過無菌小鼠Ca定植模型評估Ca分離株的免疫反應(yīng)，結(jié)果顯示促炎反應(yīng)與Ca載荷無關(guān)，相較于LD-Ca，HD-Ca在結(jié)腸中誘導(dǎo)強烈的促炎反應(yīng)，包括中性粒細胞浸潤和Th17細胞誘導(dǎo)（圖2d-f），并且加重結(jié)腸炎小鼠模型的腸道炎癥（圖 2h-i ）。因此，特定的人類腸道衍生的Ca分離株誘導(dǎo)Th17細胞和促炎免疫的顯著能力是菌株依賴性的，并且與它們造成巨噬細胞損傷的能力直接相關(guān)。

圖2 腸源性Ca誘導(dǎo)的細胞損傷和促炎免疫是菌株依賴性的

 

3. 念珠菌素促進腸道炎癥

轉(zhuǎn)錄因子增強絲狀生長蛋白1 (Efg1) 及其相關(guān)途徑與Ca共生性相關(guān)。基于CRISPR-Cas9技術(shù)敲除HD菌株EFG1基因后，Ca在腸粘膜過度生長，但其絲狀化和細胞損傷能力降低，并導(dǎo)致小鼠結(jié)腸中Th17細胞積累顯著減少（圖3a-d），且兩類Ca分離株菌絲粘附/穿透進入腸上皮細胞間無明顯差異（圖3e）。這些結(jié)果表明特定的真菌因子（而非單獨的菌絲形態(tài)）是導(dǎo)致腸道免疫激活表型的原因。ECE1是編碼念珠菌素（菌絲相關(guān)毒力因子）的基因，主要受EFG1調(diào)控。敲除ECE1基因?qū)е录毎麚p傷、小鼠結(jié)腸中Th17細胞募集和促炎免疫持續(xù)減少（圖3f-h）。這些結(jié)果表明，Ca介導(dǎo)的Th17細胞和促炎性腸免疫是菌株依賴性的，并且HD菌株中依賴Efg1調(diào)節(jié)的念珠菌素在這一過程中起關(guān)鍵作用。

圖3 HD Ca通過Efg1-Ece1依賴因子念珠菌素促進腸道促炎免疫

 

4. Ca菌株誘導(dǎo)的IL-1β反映了UC的嚴重程度

對Ca分離株進行全基因組測序，18個分離株位于不同的進化樹分枝，表明Ca菌株具有高度遺傳多樣性。研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β與特定腸道Ca菌株造成免疫細胞損傷的能力密切相關(guān)，Ca菌株誘導(dǎo)巨噬細胞損傷的能力、IL-1β（而非Ca相對豐度）與個體UC患者的疾病嚴重程度之間存在很強的正相關(guān)性（圖 4b-e）。這些結(jié)果表明菌株的功能特征，而不是真菌組成，能夠反映患者的疾病嚴重程度。IL-1R阻斷顯著減少了HD-Ca定植小鼠的中性粒細胞募集、Th17細胞積累和結(jié)腸炎癥（圖4g-j），這些數(shù)據(jù)表明IL-1信號通路在Ca誘導(dǎo)的結(jié)腸促炎免疫細胞積累中起關(guān)鍵作用。

圖4 患者特異性Ca菌株誘導(dǎo)IL-1β的能力反映了UC疾病的嚴重程度，抗IL-1R抗體治療可改善小鼠疾病
 

小編小結(jié)

本研究開發(fā)了一個轉(zhuǎn)化平臺，用于在真菌菌株和患者特定水平上對真菌生物群進行功能分析。該平臺結(jié)合了高分辨率真菌生物群測序、真菌培養(yǎng)組學(xué)和基因組學(xué)、基于CRISPR-Cas9的真菌菌株編輯系統(tǒng)、體外功能性免疫反應(yīng)性測定和體內(nèi)模型，能夠檢查人類腸道中的宿主-真菌間crosstalk。本文發(fā)現(xiàn)機會性Ca菌株具有豐富的遺傳多樣性，這些菌株在炎癥性腸病患者的結(jié)腸粘膜中占主導(dǎo)地位。人腸道來源的Ca分離株中，具有高免疫細胞損傷能力的菌株反映了UC個體患者的疾病特征，并通過IL-1β依賴性機制在體內(nèi)加重了腸道炎癥。從良性共生到致病狀態(tài)的轉(zhuǎn)變過程中，HD菌株對利基特異性炎癥免疫和產(chǎn)IL-17A的Th17細胞的抗真菌反應(yīng)依賴于Ca分泌的念珠菌素。這些發(fā)現(xiàn)揭示了人類腸道中宿主-真菌相互作用的菌株特異性，并突出了炎癥性疾病新的診斷和治療靶點。
 

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腸-免疫-靶軸系統(tǒng)研究方案

· 16s/宏基因組----腸道微生物的組成及改變

· 免疫代謝組----腸道微生物產(chǎn)生的用于調(diào)控機體免疫的代謝物

· 免疫因子組----腸道微生物如何影響機體免疫

· 轉(zhuǎn)錄/蛋白質(zhì)組----對終端靶器官應(yīng)對炎癥響應(yīng)機制的系統(tǒng)描述