蛋白質(zhì)翻譯后修飾(PTMs)是植物對(duì)環(huán)境變化反應(yīng)最快、最早的一種響應(yīng)方式，其機(jī)制和動(dòng)力學(xué)研究是植物科學(xué)的一個(gè)非常重要的領(lǐng)域。其中目前研究最多的PTM之一是磷酸化修飾。Mut9樣激酶（MLKs）是植物特異性核定位激酶家族，可磷酸化多種晝夜節(jié)律和光信號(hào)通路相相關(guān)的蛋白從而調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育。但目前對(duì)MLK激酶家族調(diào)控的各種信號(hào)通路和蛋白網(wǎng)絡(luò)的理解較少。

2021年，Molecular & Cellular Proteomics (IF 5.911)在線發(fā)表了一篇題為“Quantitative Proteomics and Phosphoproteomics Support a Role for Mut9-Like Kinases in Multiple Metabolic and Signaling Pathways in Arabidopsis”的文章，該文章利用蛋白組學(xué)和磷酸化蛋白組學(xué)發(fā)現(xiàn)了MLKs的缺失會(huì)改變硫代葡萄糖苷酶的豐度和代謝、增加植物對(duì)紫外線輻射和DNA損傷劑的敏感性，從而確定了這些激酶在調(diào)節(jié)植物次生代謝和應(yīng)激反應(yīng)中的新作用。

研究材料

擬南芥WT和mlk突變（mlk1/2/3及mlk1/3/4）幼苗
 

技術(shù)路線

· 步驟1：mlk突變體幼苗的蛋白質(zhì)組學(xué)分析；

· 步驟2：mlk突變體幼苗的磷酸化修飾質(zhì)組學(xué)的分析；

· 步驟3：顯著差異磷酸化蛋白的motif分析；

· 步驟4：顯著差異磷酸化蛋白的GO分析；

· 步驟5：mlk突變?cè)黾恿酥参飳?duì)DNA損傷的敏感性。

研究結(jié)果

1. mlk突變體幼苗的蛋白質(zhì)組學(xué)分析

作者利用TMT蛋白組學(xué)技術(shù)，分析WT、mlk突變（mlk1/2/3及mlk1/3/4）擬南芥幼苗中MLKs對(duì)蛋白質(zhì)組動(dòng)力學(xué)的調(diào)控作用（圖1）。WT和mlk突變擬南芥幼苗分別在光照和黑暗條件下放置12 h，在關(guān)燈前(ZT12)和黑暗2小時(shí)后(ZT14)分別進(jìn)行采樣。

蛋白組學(xué)共鑒定到近50000個(gè)肽對(duì)應(yīng)7500個(gè)蛋白，差異分析顯示在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)上，mlk1/2/3突變株（較于WT）中僅13個(gè)顯著差異蛋白，mlk1/3/4突變株的顯著差異蛋白數(shù)為110個(gè)（圖2），結(jié)果表明mlk1/ 3/4突變對(duì)整體蛋白質(zhì)組的影響大于mlk1/2/3突變。差異蛋白的GO分析結(jié)果表明mlk1/2/3 ZT12、mlk1/3/4 ZT12、mlk1/3/4 ZT14組的上調(diào)蛋白主要富集在GLS（硫代葡萄糖苷）生物合成和相關(guān)過(guò)程上，下調(diào)蛋白主要富集在GLS分解代謝過(guò)程中（圖3）。

為了驗(yàn)證MLKs參與GLS代謝調(diào)節(jié)，作者在ZT12時(shí)定量分析GLS的水平峰值，結(jié)果表明在mlk1/2/3和mlk1/3/4突變體幼苗（與野生型相比）中，脂肪族GLSs的含量均有所增加且與GLS相關(guān)生物合成酶的豐度增加有關(guān)（圖4）。

圖1 TMT蛋白組學(xué)流程


圖2 蛋白組學(xué)顯著差異分析


圖3 顯著差異蛋白的GO分析

圖4 mlk突變株幼苗含有較高水平的（met衍生的）硫代葡萄糖苷

2. mlk突變體幼苗的磷酸化修飾質(zhì)組學(xué)的分析

作者采用TMT磷酸化的方式對(duì)WT和mlk突變體幼苗進(jìn)行磷酸化組學(xué)分析，總共鑒定到23386個(gè)磷酸化位點(diǎn)（對(duì)應(yīng)15222個(gè)肽段），修飾位點(diǎn)所在的氨基酸分布均以Ser居多（圖5A）。差異比較分析結(jié)果顯示相較于WT組，mlk1/3/4 ZT12、mlk1/3/4 ZT14的顯著差異磷酸化肽段數(shù)分別均比mlk1/2/3 ZT12、mlk1/2/3 ZT14的多，由此證明在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)上尤其是在Z12時(shí)，mlk1/3/4突變體對(duì)磷酸化蛋白組的影響大于mlk1/2/3突變體（圖5B）。這一結(jié)果證明了mlk是以光依賴的方式調(diào)節(jié)磷酸化蛋白質(zhì)組。

對(duì)兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的差異蛋白的共有蛋白進(jìn)行分析（圖5C和5D），結(jié)果顯示它們主要參與了基因沉默和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)通路，但部分參與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的蛋白僅在兩種突變體的ZT12時(shí)間點(diǎn)上發(fā)生了顯著改變，由此說(shuō)明MLKs參與調(diào)控基因表達(dá)，且可能通過(guò)調(diào)節(jié)光依賴的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。

圖5 mlk突變體幼苗的磷酸化蛋白組學(xué)分析

3. 顯著差異磷酸化蛋白的motif分析

顯著差異的磷酸化肽段進(jìn)行motif分析，結(jié)果顯示顯著上調(diào)、下調(diào)的磷酸化肽段分別展示出多種不同的motif基序（圖6A和6B），這些基序均與一些特定的激酶相關(guān)。這些基序的多樣性，表明MLK家族激酶通過(guò)系統(tǒng)調(diào)控多種激酶信號(hào)網(wǎng)絡(luò)影響了許多生物過(guò)程。

圖6 顯著差異磷酸化肽段的motif分析
 

4. 顯著差異磷酸化蛋白的GO分析

對(duì)mlk兩種突變體在ZT12和ZT14的顯著差異磷酸化蛋白的GO富集分析，發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞成分（cc）類(lèi)別中，與細(xì)胞核相關(guān)的條目均高度富集（圖7A），結(jié)果表明MLKs主要定位在細(xì)胞核中。在生物過(guò)程（bp）類(lèi)別中，與染色質(zhì)修飾相關(guān)的通路及蛋白均被富集（圖7B和7C），結(jié)果表明MLKs在染色質(zhì)結(jié)果中發(fā)揮作用。

對(duì)mlk1/3/4 ZT12突變幼苗的顯著差異磷酸化蛋白的GO富集分析發(fā)現(xiàn)主要分布在節(jié)律過(guò)程和/或晝夜節(jié)律的過(guò)程中，證明了mlk與光信號(hào)和晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)有相關(guān)性。

圖7 顯著差異磷酸化蛋白的GO 分析
 

5. mlk突變?cè)黾恿酥参飳?duì)DNA損傷的敏感性

由于ZT12時(shí)間點(diǎn)上的mlk1/3/4的缺失對(duì)整體蛋白組和磷酸化修飾組的影響最大，因此，作者針對(duì)mlk1/3/4 ZT12數(shù)據(jù)集中顯著上調(diào)、顯著下調(diào)的磷酸化蛋白分別做GO分析（圖8）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)下調(diào)蛋白的富集生物過(guò)程中包含細(xì)胞對(duì)DNA損傷刺激的反應(yīng)條目。為進(jìn)一步驗(yàn)證MLKs在DNA損傷反應(yīng)中的作用，作者評(píng)估了突變體和WT幼苗對(duì)基因毒性試劑MMS和UV-C的敏感性。結(jié)果表明隨著MMS水平的增加，幼苗重量逐漸減少、褪綠組織增多、生長(zhǎng)發(fā)育受損，相較于WT組，突變體的敏感性更高（圖9A-9D），暴露于多劑量UV-C輻照時(shí)，mlk突變體對(duì)紫外線誘導(dǎo)的DNA損傷也更敏感（圖9E）。綜上所述mlk突變體增加了對(duì)DNA損傷的敏感性。

圖8 mlk1/3/4 ZT12顯著差異磷酸化蛋白的GO分析


圖9 mlk突變體對(duì)DNA損傷的敏感性
 

小編小結(jié)

在這項(xiàng)研究中，作者對(duì)WT和mlk突變體幼苗在兩個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行了深入的蛋白質(zhì)組和磷酸化修飾蛋白組學(xué)的定量分析。結(jié)果顯示MLK突變幼苗改變了硫代葡萄糖苷(GLS)代謝酶的豐度，以及參與一系列不同生物過(guò)程(包括RNA加工、染色質(zhì)組織)的蛋白質(zhì)磷酸化差異。此外，mlk也可能調(diào)控?cái)M南芥的DNA損傷反應(yīng)。

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