局部晚期非小細胞肺癌(LA-NSCLC)患者在臨床診療中占比相對較高、預后較差且異質性較大，年生存率僅在15%-30%。放療是LA-NSCLC主要局部治療手段，然而放療抵抗嚴重限制了臨床患者整體療效。因此，尋找放療敏感性相關標志物及信號通路，為臨床個體化治療提供依據(jù)尤為重要。

上海交大附屬胸科醫(yī)院團隊利用DIA組學技術發(fā)現(xiàn)NSCLC放射敏感性標志物。2021年，上海交通大學附屬胸科醫(yī)院傅小龍教授課題組在International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics（IF 7.038）雜志上發(fā)表題目為 "Radiosensitivity-specific proteomic and signaling pathway network of non-small cell lung cancer"的研究成果，利用DIA蛋白組學技術在NSCLC細胞系和臨床組織中深入研究NSCLC放射敏感性的潛在分子機制，發(fā)現(xiàn)并驗證了放射敏感性蛋白標志物。中科新生命為本研究提供了DIA蛋白組學的技術支持。

研究材料
NSCLC細胞系和組織石蠟切片
 
技術路線
步驟1：NSCLC細胞系蛋白組分析尋找放射敏感性相關蛋白及通路；
步驟2：NSCLC患者組織蛋白組分析研究放射敏感性標志蛋白及通路；
步驟3：NSCLC放射敏感性蛋白的功能驗證；
步驟4：NSCLC放射敏感性蛋白臨床驗證與數(shù)據(jù)分析。
 
研究結果

1. 非小細胞肺癌細胞系的蛋白質組學研究
為獲得非小細胞肺癌（NSCLC）細胞系的蛋白質組，作者篩選出29個人NSCLC細胞系，利用DIA蛋白組技術共檢測到6876個蛋白質，其中3371個蛋白質在所有細胞中均有表達。3371個共有蛋白的GO和KEGG分析表明，NSCLC蛋白主要富集在代謝和生物合成通路、細菌或病毒感染相關通路以及人類疾病相關的信號通路中。綜上，NSCLC的發(fā)生可能與細胞代謝、生物合成紊亂以及細菌或病毒感染有關。

 
2.NSCLC放射敏感性蛋白及通路篩選
作者通過放射后克隆存活來分析29個人NSCLC細胞系的放射敏感性（SF2），相關性分析找到SF2顯著相關的27個放射敏感性蛋白，對27個蛋白進行PPI分析，確定了595個與放射敏感性蛋白相互作用的蛋白。對上述622個互作蛋白的GO和KEGG分析發(fā)現(xiàn)，這些蛋白主要與細胞鈣粘附素結合、連接酶、蛋白質結合以及各種酶活性有關，主要富集于先前報道的放射敏感性相關信號通路（VEGF、ErbB、HIF-1和EGFR7）。綜上，NSCLC的放射敏感性與細胞間的粘附和細胞運動有關。

 
3. 組織石蠟樣本中放射敏感性蛋白和富集通路分析
為了驗證NSCLC細胞系中發(fā)現(xiàn)的放射敏感性通路，作者進一步用DIA蛋白組技術檢測了12個石蠟包埋的人NSCLC樣本，共鑒定出5511個蛋白質。石蠟樣本共有的蛋白有2563個，其中1753個在NSCLC細胞系也鑒定到。此外石蠟樣本共有的2563個蛋白質的GO和KEGG分析結果與NSCLC細胞系的一致。根據(jù)患者的局部無進展生存(LPFS)時間，12例石蠟標本被分為兩組：放射響應好(RRG；LPFS≥1.5年)和放射響應差(RRP；LPFS<1.5年)。無監(jiān)督層次聚類和PCA分析顯示RRG和RRP組可以很好地分離。與RRG 相比，RRP組有44個蛋白質差異表達，PPI分析獲得1015個放射敏感性相關蛋白。GO和KEGG分析表明，NSCLC細胞系與石蠟樣本間有38條與放射敏感性相關的信號通路重疊。重疊的通路中的22個差異蛋白與NSCLC的放射敏感性相關，PPI分析顯示，關鍵的中樞蛋白ILK、IQGAP1和PAK1形成互作網(wǎng)絡，該網(wǎng)絡中8種蛋白（ILK、IQGAP1、PAK1、IQGAP2、STAT1、STAT5B、HSPA2和Bag2）的表達與SF2呈正相關，表明8種蛋白的高表達可能誘導NSCLC產(chǎn)生放射抗性。

圖3 NSCLC石蠟樣本中的放射敏感性蛋白和富集途徑

 
4. 放射敏感性相關蛋白在NSCLC細胞系中的表達驗證
通過Western blot、免疫熒光和qPCR驗證了NSCLC細胞系中差異表達的8個蛋白在放射抵抗細胞中表達水平都增加。為了確定找到的放射敏感性相關蛋白是否在放射抗性中發(fā)揮作用，作者對ILK、IQGAP1和PAK1三種關鍵的中樞蛋白的功能進行了驗證，發(fā)現(xiàn)單基因敲除的NSCLC細胞中放射誘導的凋亡比例增加，有顯著的放射增敏作用。

圖4 NSCLC放射敏感性蛋白的表達驗證

 
5. NSCLC患者放射敏感性相關蛋白的驗證
為進一步驗證放射敏感性相關蛋白在臨床患者中的表達，作者選取13例接受根治性放療的NSCLC患者的石蠟標本，免疫組化顯示，6個蛋白ILK、IQGAP1、PAK1、IQGAP2、STAT1和STAT5B在RRP患者中高表達。生存分析顯示6個蛋白的表達與接受根治性放療的NSCLC患者的LPFS相關，證明了這6個蛋白作為放射敏感性標志物的潛力。

 
6. NSCLC放射敏感性的信號調控網(wǎng)絡
結合前人的研究和本研究結果，作者推測非小細胞肺癌放射敏感性的機制可能與ILK、PAK1和IQGAP1有關：細胞中高濃度的ILK激活IQGAP1，促進IQGAP1-rac1/Cdc42復合物的形成。活化的CdC42誘導PAK1下游效應蛋白的磷酸化。磷酸化的PAK1通過抑制E-cadherin的轉錄，進一步激活Snail，促進PAK1/Snail復合物的形成，從而誘導EMT和放射抗性。

圖6 NSCLC放射敏感性的信號調控網(wǎng)絡

 

 
 小編小結
本研究利用DIA蛋白組學檢測技術建立了NSCLC細胞系和腫瘤石蠟組織的蛋白質組圖譜，從中發(fā)現(xiàn)并驗證了非小細胞肺癌放射敏感性特異蛋白，描繪了非小細胞肺癌放射敏感性相關信號通路的圖譜網(wǎng)絡。本研究不僅加深了我們對非小細胞肺癌放射敏感性機制的理解，篩選到的NSCLC放射敏感性的蛋白標志物也為臨床個體化放療提供了新的方向。