如何避免高靈敏度HPLC、GC及MS分析中的鬼峰

瀏覽次數(shù)：2636　發(fā)布日期：2022-2-24　來源：賽多利斯

Overview
在樣品儲(chǔ)存和樣品制備過程中，化合物會(huì)從日常的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備中浸出。這些化合物會(huì)在HPLC、GC 和MS 的圖譜中引入不需要的鬼峰，并在包括分析質(zhì)量控制在內(nèi)的一系列活動(dòng)中干擾樣品分析。使用HPLC、GC-MS 和LC-MS，對(duì)賽多利斯Optifit 和Safetyspace^®濾芯吸頭及其低吸附吸頭在移取易溶出樣品時(shí)的浸出物情況進(jìn)行了測(cè)試。這些移液器吸頭被證明實(shí)際上不含浸出化合物，因此適用于高度敏感的分析方法。

引言

塑料器具被廣泛用于實(shí)驗(yàn)室環(huán)境，但低品質(zhì)的產(chǎn)品可能會(huì)對(duì)高精度的分析產(chǎn)生影響。污染源可能是樣品管、微孔板、移液器吸頭和塑料注射器，它們可以浸出著色劑和增塑劑，如鄰苯二甲酸鹽或DiHEMDA( 二(2-羥乙基) 甲基十二烷基銨)，導(dǎo)致鬼峰并干擾分析結(jié)果。為避免出現(xiàn)鬼峰，許多實(shí)驗(yàn)室已將常用的一次性塑料器具更換為需要清潔和預(yù)潤(rùn)洗的玻璃器皿。

在本研究中，使用高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)和液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)法，然后在乙醇和DMSO中萃取，從而對(duì)賽多利斯Optifit和Safetyspace^® 濾芯吸頭及其低吸附吸頭的化學(xué)浸出物進(jìn)行分析。這些溶劑的選擇是基于它們的廣泛使用以及與較溫和的溶劑(如水)相比的腐蝕性，后者可能不會(huì)產(chǎn)生相同水平的潛在污染物。

方法

實(shí)驗(yàn)室設(shè)備相關(guān)的浸出物測(cè)試
使用100μl的1)乙醇或2)DMSO沖洗各種移液器吸頭（200μl Optifit 吸頭(產(chǎn)品編號(hào)790200)、Safetyspace^®濾芯吸頭(產(chǎn)品編號(hào)790201F)和低吸附吸頭( 產(chǎn)品編號(hào)LH-L790200和LH-LF790201))，將溶劑吸入移液器吸頭，保持5秒鐘并直接分液到樣品試管中。使用多個(gè)相同類型的移液器吸頭(5個(gè)移液器吸頭，共500μL，混合樣品) 產(chǎn)生足夠的測(cè)試體積，通過HPLC-UV/VIS、GC-MS或LC-HRMS 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室設(shè)備相關(guān)的浸出物分析。

HPLC-UV/VIS
將乙醇提取物進(jìn)樣至配備Nucleosil C18(5μm × 250mm × 4.6mm) 色譜柱和紫外/可見光(UV/VIS) 檢測(cè)器的Agilent 1200 infinity(Agilent TechnologiesInc.，California，USA)HPLC系統(tǒng)。流速：1ml/min；波長(zhǎng)：220nm；進(jìn)樣體積：20μl；溫度：40°C；流動(dòng)相：A) 乙腈 | B) 水

GC-MS
通過液- 液萃取制備乙醇和水提取物，并進(jìn)樣至Clarus 600GC-Clarus 600TMS Turbo(PerkinElmer Inc.，Massachusetts，USA) 和C18 Elite-5MS(60m×0.25mm×0.25μm) 色譜柱。通過使用內(nèi)標(biāo)2-氟聯(lián)苯(10μg/ml) 進(jìn)行液體注射，使用甲苯-d8(0.1μg/ml) 進(jìn)行頂空注射，進(jìn)行半定量。

LC-MS
將乙醇和DMSO提取物直接進(jìn)樣至配備BEH C18(1.7μm，2.1×100mm) 色譜柱的Waters ACQUITY UPLC I-Class-Waters Xevo G2-XS QTof(Waters Corp，Massachusetts，USA)LC-MS 系統(tǒng)中( 流速：0.5ml/min；進(jìn)樣體積：1μl；溫度：40°C；流動(dòng)相：A) 乙腈 | B) 含有10mmolNH4CH3COO 的水，梯度：0–0.5 分鐘 5% A，0.5-9分鐘 5% A，9-39.5 分鐘 99% A，39.5-40分鐘 5%A)。通過分別對(duì)空白樣品與樣品的堿基峰離子(BPI) 色譜圖，以及空白樣品與樣品的UV/VIS 色譜圖進(jìn)行目視對(duì)比，來進(jìn)行篩選。

結(jié)果

對(duì)賽多利斯Optifit和Safetyspace^®濾芯吸頭及其低吸附吸頭進(jìn)行了GC-MS和LC-MS分析。通過GC-MS對(duì)油酰胺進(jìn)行定量，最大濃度為0.11ppm( 定量限，LOQ，0.01ppm；圖1)；使用LC-MS對(duì)芥酸酰胺( 圖2-3) 和bDtBPP( 雙(2,4-二叔丁基苯基)- 磷酸酯；圖4) 進(jìn)行定量，最大濃度為0.14ppm(LOQ 0.001ppm) 和.026ppm(LOQ，0.001ppm)。此外，在GC-MS中，對(duì)Optifit低吸附吸頭中的十六烷酸乙酯進(jìn)行定量，最大濃度為0.25ppm，檢測(cè)到一種保留時(shí)間為8.32分鐘的未知化合物，最大濃度為0.13ppm，但其結(jié)構(gòu)信息不足，因此無法對(duì)其進(jìn)行表征。在HPLC-UV/VIS 中，在Optifit低吸附吸頭中僅發(fā)現(xiàn)了少量普遍存在的抗氧化劑Irgafos 168(CAS 95906-11-9)。未檢測(cè)到超出其定量限的其他化合物(表1)。

圖1. 使用GC-MS對(duì)賽多利斯移液器吸頭EtOH提取物的化學(xué)浸出物進(jìn)行分析。保留時(shí)間：油酰胺，19.28分鐘；芥酸酰胺，22.66分鐘( 結(jié)果低于檢測(cè)限)；未知化合物，8.32分鐘；十六烷酸乙酯，25.20 分鐘；內(nèi)標(biāo)Irganox 1035，12.35分鐘。

圖2. 使用LC-HRMS(ESI+)對(duì)賽多利斯移液器吸頭EtOH提取物的化學(xué)浸出物進(jìn)行分析。保留時(shí)間：芥酸酰胺，9.84分鐘；內(nèi)標(biāo)Irganox 1035，9.27分鐘。

圖3. 使用LC-HRMS(ESI-)對(duì)賽多利斯移液器吸頭DMSO提取物的化學(xué)浸出物進(jìn)行分析。保留時(shí)間：芥酸酰胺，9.84分鐘；內(nèi)標(biāo)Irganox 1035，9.24分鐘。

圖4. 使用LC-MS(ESI+)對(duì)賽多利斯移液器吸頭EtOH提取物的化學(xué)浸出物進(jìn)行分析。保留時(shí)間：bDtBPP,6.97分鐘；內(nèi)標(biāo)Irganox 1035，9.26分鐘。

圖5. 使用HPLC-UV/VIS對(duì)賽多利斯移液器吸頭EtOH提取物的化學(xué)浸出物進(jìn)行分析。保留時(shí)間：Irgafos 168，40.17分鐘；內(nèi)標(biāo)Irganox 1035( 硫代二亞乙基雙[3-(3,5- 二叔丁基-4- 羥基苯基) 丙酸酯]，CAS 41484-35-9)，30.00分鐘。

結(jié)論

從賽多利斯移液器吸頭中定量的浸出物水平低于文獻(xiàn)中報(bào)告的每種化合物所報(bào)告的相關(guān)濃度(表1)。觀察到的具有抗炎作用生物學(xué)相關(guān)濃度：油酰胺，100ppm(Yang 2016)；芥酸酰胺，0.338ppm(Watson 2009)；bDtBPP 對(duì)CHO 細(xì)胞生長(zhǎng)有抑制作用，濃度為0.035-0.1ppm(Kelly 2016)；DiHEMDA，0.03ppm(McDonald 2008)。

因此，在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室操作或生物分析樣品的制備中使用賽多利斯Optifit和Safetyspace^® 濾芯吸頭及其低吸附吸頭，預(yù)計(jì)不會(huì)對(duì)敏感的生物或生化分析產(chǎn)生干擾。

化合物	CAS登記號(hào)	定量含量(ppm)	LOQ (ppm)
芥酸酰胺	CAS 112-84-5	0.009-0.14	0.001
bDtBPP	CAS 69284-93-1	0.02-0.026	0.001
油酰胺	CAS 301-02-0	<0.01*-0.11	0.01
BBP，鄰苯二甲酸丁芐酯	CAS 85-68-7 -	-†	0.01
雙( 甲基乙二醇) 鄰苯二甲酸酯	CAS 117-82-8	-†	0.01
DBP，鄰苯二甲酸二丁酯	CAS 84-74-2	-†	0.1
DEHP，鄰苯二甲酸二(2- 乙基己) 酯	CAS 117-81-7	-†	0.1
DiHEMDA	CAS 22340-01-8	-†	未確定‡