三代全長(zhǎng)16S/18S/ITS擴(kuò)增子測(cè)序的介紹

瀏覽次數(shù)：1915　發(fā)布日期：2022-2-18　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

三代微生物多樣性是基于PacBio SequelⅡ測(cè)序平臺(tái)，利用單分子實(shí)時(shí)測(cè)序的方法，對(duì)原核生物16S的全部V1-V9可變區(qū)域或真核生物的18S高變區(qū)域或ITS區(qū)域進(jìn)行全長(zhǎng)擴(kuò)增，不僅能提高物種鑒定的分辨率，還能提高樣本中微生物組成鑒定的精確度，從而更全面的反應(yīng)微生物的群落結(jié)構(gòu)。

一、PacBio測(cè)序原理
利用與二代測(cè)序相同的邊合成邊測(cè)序的原理，以SMRT芯片為載體；模板與特殊聚合酶結(jié)合后，4種不同熒光標(biāo)記的脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）通過布朗運(yùn)動(dòng)隨機(jī)進(jìn)入檢測(cè)區(qū)與聚合酶結(jié)合，按DNA模板序列延伸；通過檢測(cè)單個(gè)DNA分子的合成所產(chǎn)生的信號(hào)來進(jìn)行測(cè)序，也可通過檢測(cè)相鄰兩個(gè)堿基的測(cè)序時(shí)間，來檢測(cè)一些堿基修飾情況。

圖1. PacBio測(cè)序原理^[1]

二、產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)
于二代測(cè)序只能獲取1~2個(gè)高變區(qū)短讀長(zhǎng)序列而言，三代測(cè)序能一次性測(cè)到所有高變區(qū)，同時(shí)也可以避免不同引物帶來的偏好性，從而提高微生物群落的分類學(xué)分辨率。
1.更長(zhǎng)讀長(zhǎng)，更高準(zhǔn)確率^[2]

圖2. 測(cè)序長(zhǎng)度和準(zhǔn)確度

2.更高的物種鑒定分辨率和精確度^[3]

圖3. 物種鑒定結(jié)果

3.更準(zhǔn)確的還原微生物群落^[4]

圖4. 微生物群落分布

三、技術(shù)路線

圖5. 技術(shù)流程圖

四、案例分享
文章標(biāo)題：三代全長(zhǎng)微生物多樣性研究母嬰微生物群^[5]
研究小結(jié)：早期微生物與成年后疾病的發(fā)生發(fā)展有一定的關(guān)系，研究發(fā)現(xiàn)子宮、胎便、羊水和胎盤都有微生物存在，那么嬰兒胎便微生物來源與母體不同來源的樣本的關(guān)系如何呢？本文以39對(duì)母嬰的產(chǎn)婦樣本（羊水、糞便、陰道分泌物和唾液）和嬰兒胎便樣品為研究對(duì)象，基于PacBio三代全長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)進(jìn)行16S rRNA檢測(cè)。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)不同類型樣本間α多樣性和β多樣性存在特異性；同時(shí)除發(fā)現(xiàn)不同類型樣本各自的一些優(yōu)勢(shì)菌（其中羊水和陰道分泌物的優(yōu)勢(shì)菌為L(zhǎng)actobacillus和Curvibacter，胎便的優(yōu)勢(shì)菌為Bacillus 和Escherichia/Shigella，產(chǎn)婦糞便的優(yōu)勢(shì)菌為Bacteroides和Faecalibacterium，產(chǎn)婦唾液的優(yōu)勢(shì)菌為Streptococcus和Prevotella）外，還發(fā)現(xiàn)了他們間共有OTUs，其中胎便菌群與羊水菌群的共有OTUs多于產(chǎn)婦糞便菌群和陰道菌群，由此推斷羊水菌群相比其他位點(diǎn)貢獻(xiàn)更大。此外，發(fā)現(xiàn)剖腹產(chǎn)和順產(chǎn)胎兒的胎便和羊水微生物群落結(jié)構(gòu)無顯著差異。

圖6. 文章部分結(jié)果

參考文獻(xiàn)：

[1] Mohit K Midha, Mengchu Wu , Kuo-Ping Chiu. Long-read sequencing in deciphering human genetics to a greater depth. Hum Genet . 2019 Dec;138(11-12):1201-1215.
[2]PacBio. 2022. PacBio Sequel Systems-PacBio.[online]Availableat: [Accessed 14 February 2022].
[3] Jethro S Johnson, et al. Evaluation of 16S rRNA gene sequencing for species and strain-level microbiome analysis. Nat Commun. 2019 Nov 6;10(1):5029.
[4] Esther Singer, et al. High-resolution phylogenetic microbial community profiling. ISME J.2016 Aug;10(8):2020-32.
[5] Qiuwen He, et al. The meconium microbiota shares more features with the amniotic fluid microbiota than the maternal fecal and vaginal microbiota. Gut Microbes. 2020 Nov 9;12(1):1794266.

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