細(xì)胞外囊泡（Extracellular Vesicles，EVs）攜帶大量的細(xì)胞特異性的生物活性分子，核酸、蛋白質(zhì)、脂類和糖類等，在機(jī)體很多生理病理過程中發(fā)揮重要的作用。外泌體可通過傳遞信息影響靶細(xì)胞的功能，激活細(xì)胞信號通路，在免疫、凝血、腫瘤等生理病理過程中發(fā)揮作用。EVs甚至可能通過攜帶聚集蛋白傳播疾病，如神經(jīng)退行性變疾病。

 

蛋白質(zhì)的差異表達(dá)是區(qū)分不同來源外泌體的重要特點(diǎn)，是研究外泌體起源的重要途徑。蛋白質(zhì)組學(xué)已經(jīng)逐漸成為研究各種亞細(xì)胞組分蛋白質(zhì)組的重要工具。針對外泌體進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究，可以揭示疾病發(fā)病機(jī)制、尋找疾病診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物、篩選疾病治療靶點(diǎn)等。

 

近20年來外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)表文章趨勢

（數(shù)據(jù)來源：PubMed，數(shù)據(jù)至2021年7月）

 

 

外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)流程

 
外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用

外泌體中的蛋白質(zhì)居多，外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用廣泛，研究外泌體蛋白質(zhì)在免疫調(diào)節(jié)、抗原呈遞、癌癥轉(zhuǎn)移、腫瘤浸潤、血管生成、神經(jīng)發(fā)育中的生物學(xué)功能，標(biāo)志物的篩選與鑒定、藥物靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)以及功能機(jī)制中的作用以及疾病診斷、治療和預(yù)后等。

  外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)案例分享

案例一：通過定量蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定人轉(zhuǎn)移性黑色素瘤組織細(xì)胞外囊泡亞群

 

轉(zhuǎn)移性黑色素瘤組織酶處理后，差速超速離心分離出不同大小的細(xì)胞外囊泡，然后將其進(jìn)一步分為高密度（HD）和低密度（LD）部分。然后使用電鏡、NTA和TMT定量質(zhì)譜分析對所有EVs亞種群進(jìn)行深入分析。

 

TMT定量蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果顯示，大型和小型LD EVs均富集了flotillin-1等幾種蛋白質(zhì)，ADAM10僅富集在小型LD EVs中，而mitofilin僅富集在大型EVs中。

 

聚類分析結(jié)果表明HD EVs 和LD EVs中蛋白表達(dá)差異。

 

案例二：外泌體來源ENO1調(diào)節(jié)整合素α6β4表達(dá)促進(jìn)肝癌生長和轉(zhuǎn)移

 

α-烯醇化酶（ENO1）在幾種人類惡性腫瘤中被發(fā)現(xiàn)失調(diào)，包括肝細(xì)胞癌（HCC）。

 

文章證明ENO1在HCC細(xì)胞或組織中上調(diào)，在高轉(zhuǎn)移性HCC細(xì)胞或轉(zhuǎn)移性組織以及來源于高轉(zhuǎn)移源的外泌體中表達(dá)更高。

 

ENO1表達(dá)與肝癌患者的腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（TNM）分期、分化程度和不良預(yù)后有關(guān)。ENO1可以通過外泌體介導(dǎo)在HCC細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移，表現(xiàn)出類似于HCC細(xì)胞中ENO1過度表達(dá)的效果，其通過上調(diào)整合素α6β4表達(dá)和激活FAK/Src-p38MAPK通路促進(jìn)ENO1低表達(dá)HCC細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。

 

 

數(shù)據(jù)表明，外泌體來源ENO1對于促進(jìn)肝癌生長、轉(zhuǎn)移和進(jìn)一步惡化患者至關(guān)重要。這項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)了一種新的生物標(biāo)志物用于臨床評估肝癌進(jìn)展，特別是預(yù)測肝癌轉(zhuǎn)移風(fēng)險。

 

通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析確定ENO1在LO2exo、HepG2exo、MHCC97Lexo和HCCLM3exo中的表達(dá)水平及差異表達(dá)。

 

逍鵬生物Dr.Cell 實(shí)驗(yàn)室提供外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)服務(wù)

#TMT，#DIA，#4D Label Free，#Shotgun

 

✦TMT標(biāo)記定量蛋白組學(xué)

 

TMT (Tandem mass tag)是由ThermoFisher Scientific公司研發(fā)的一種多肽體外等重同位素標(biāo)記的相對與絕對定量技術(shù)，采用6、10及16種同位素的標(biāo)簽，通過特異性標(biāo)記多肽的氨基基團(tuán)，經(jīng)高分辨質(zhì)譜儀串聯(lián)分析，可同時比較多達(dá)16種樣品之間的蛋白質(zhì)表達(dá)量，是定量蛋白質(zhì)組學(xué)中經(jīng)典的高通量篩選技術(shù)。

 

實(shí)驗(yàn)流程

 

技術(shù)優(yōu)勢

• 同一批次標(biāo)記的樣本統(tǒng)一處理，減少人為操作和實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)不穩(wěn)定造成的偏差，實(shí)驗(yàn)平行性較高；

• 同一批次標(biāo)記定量穩(wěn)定性高；

• 通過分級方法增加蛋白鑒定深度。

應(yīng)用領(lǐng)域

• 疾病標(biāo)志物篩選

• 分子機(jī)制研究

• 植物抗逆研究

• 藥物作用靶點(diǎn)研究

• 特殊功能蛋白質(zhì)篩選

 

✦DIA蛋白質(zhì)組學(xué)

 

DIA（data-independent acquisition，數(shù)據(jù)非依賴性采集）技術(shù)是新一代蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)，被Nature Methods雜志評為2015年最值得關(guān)注的技術(shù)。

 

DIA采用數(shù)據(jù)非依賴性掃描模式：將質(zhì)譜整個全掃描范圍分為若干個窗口，然后對每個窗口中的所有離子進(jìn)行檢測、碎裂，從而無遺漏、無差異地獲得樣本中所有離子的信息。從而降低樣本檢測的缺失值，同時提高定量準(zhǔn)確性和重復(fù)性，實(shí)現(xiàn)大樣本隊(duì)列中高穩(wěn)定，高精準(zhǔn)的蛋白質(zhì)組定量分析。 

與DDA（data dependent acquisition，數(shù)據(jù)依賴性采集）技術(shù)相比，DIA技術(shù)的優(yōu)勢包括：

（1）數(shù)據(jù)采集更完整；

（2）減少采集的隨機(jī)性，檢測重現(xiàn)性、穩(wěn)定性更好；

（3）更能檢測到低豐度信號。

 

DIA與DDA數(shù)據(jù)采集模式的區(qū)別

 

✦Label free 蛋白質(zhì)組學(xué)

 

Label free是一種不依賴于同位素標(biāo)記的非標(biāo)記蛋白組定量技術(shù)，通過液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對蛋白質(zhì)酶解肽段進(jìn)行質(zhì)譜分析，無需使用昂貴的穩(wěn)定同位素標(biāo)簽做內(nèi)標(biāo)，只需分析大規(guī)模鑒定蛋白質(zhì)時所產(chǎn)生的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，比較不同樣品中相應(yīng)肽段的信號強(qiáng)度，從而對肽段對應(yīng)的蛋白質(zhì)進(jìn)行相對定量。

 

TMT、Label Free、DIA如何選擇

 

✦Shotgun

 

Shotgun（鳥槍法）是定性鑒定蛋白質(zhì)混合物中蛋白質(zhì)組成最常見、最方便有效的方法。

原理

將樣本中的蛋白質(zhì)酶解成肽段，經(jīng)液相色譜分離進(jìn)入質(zhì)譜儀后先記錄其一級信號，隨后外加能量將其碎裂后再記錄其二級信號。采用相應(yīng)的軟件還原樣本中的蛋白質(zhì)組信息。

 

技術(shù)優(yōu)勢

可全面鑒定復(fù)雜混合樣品的大量蛋白質(zhì)。

 

實(shí)驗(yàn)流程

Dr.Cell實(shí)驗(yàn)室根據(jù)研究者的不同需求，提供差異化的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)服務(wù)。

 

Dr.Cell實(shí)驗(yàn)室提供外泌體整體服務(wù)方案

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參考文獻(xiàn)

• Rossella C. et al. Subpopulations of extracellular vesicles from human metastatic melanoma tissue identified by quantitative proteomics after optimized isolation.Journal of Extracellular Vesicles. 2020,9:1. 

• Keqiu Jiang. et al. Exosome-derived ENO1 regulates integrin α6β4 expression and promotes hepatocellular carcinoma growth and metastasis. Cell Death & Disease. 2020,11:972.