對(duì)于疾病研究，生物標(biāo)志物（Biomarker）是指可供客觀測(cè)定和評(píng)價(jià)的一個(gè)普通生理病理或治療過(guò)程中的某種特征性的生化指標(biāo)，通過(guò)測(cè)定可以獲知機(jī)體當(dāng)前所處的生物學(xué)過(guò)程中的進(jìn)程。檢查一種疾病特異性的生物標(biāo)志物，不僅可從分子水平探討發(fā)病機(jī)制，而且在準(zhǔn)確、敏感地評(píng)價(jià)早期、低水平的損害方面有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，可提供早期預(yù)警、預(yù)后療效分析、疾病精準(zhǔn)的分期分型依據(jù)等。尋找和發(fā)現(xiàn)有價(jià)值的生物標(biāo)志物已經(jīng)成為目前研究的一個(gè)重要熱點(diǎn)。

蛋白質(zhì)是執(zhí)行生物學(xué)功能的活性生物大分子，和傳統(tǒng)方法相比，蛋白質(zhì)組學(xué)能夠更直接地鑒定到病人和正常人之間差異表達(dá)的蛋白，成為發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物的重要途徑。

今天隨小希一起學(xué)習(xí)一種外泌體蛋白組學(xué)常見(jiàn)研究模式——通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)尋找疾病發(fā)生發(fā)展的新型標(biāo)志物。

案例：阿爾茲海默癥潛在非侵入性早期生物標(biāo)志物鑒定—外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)分析
 
研究背景

阿爾茲海默癥（AD）是常見(jiàn)的老年性疾病，是一種不可治愈的神經(jīng)退行性疾病。患者大腦中會(huì)出現(xiàn)淀粉樣蛋白斑塊沉積，這些沉積物能破壞腦神經(jīng)組織的結(jié)構(gòu)與功能，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡和認(rèn)知功能喪失。阿爾茲海默癥在β-淀粉樣斑塊沉積發(fā)生之前，識(shí)別候選生物標(biāo)志物對(duì)于AD的早期干預(yù)具有重要意義。

樣本來(lái)源

5XFAD小鼠及同窩對(duì)照小鼠的尿液樣本。5XFAD小鼠攜帶5個(gè)家族性基因突變的APP/PS1轉(zhuǎn)基因AD小鼠模型，該小鼠重現(xiàn)了阿爾茲海默癥淀粉樣蛋白病理的主要特征，可作為研究AD發(fā)病機(jī)制、治療靶點(diǎn)及治療藥物的動(dòng)物模型。

技術(shù)方法

蛋白質(zhì)組學(xué)、生物信息學(xué)分析、多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）、WB（Western blot）、ELISA。

研究目的

研究1月齡（β-淀粉樣斑塊沉積前）的小鼠模型與對(duì)照小鼠尿液外泌體蛋白質(zhì)組，探討潛在AD早期生物標(biāo)志物。

技術(shù)路線
研究?jī)?nèi)容

STEP1
樣本收集


收取5XFAD小鼠及同窩對(duì)照小鼠的尿液樣本，分離提取外泌體。

STEP2
外泌體鑒定


NTA粒徑濃度分析：對(duì)照組和5XFAD組的尿液來(lái)源外泌體進(jìn)行NTA定量分析，其外泌體的平均直徑分別為120.8±43.0 nm和103.2±34.1 nm 。5XFAD組尿液來(lái)源外泌體平均直徑小于對(duì)照組，但5XFAD組尿液外泌體濃度高于對(duì)照組。
TEM電鏡驗(yàn)證外泌體形態(tài)：呈扁平球形或圓形，雙層膜結(jié)構(gòu)。
WB驗(yàn)證外泌體標(biāo)志物表達(dá)：檢測(cè)到外泌體跨膜蛋白：CD10、CD63和Flotillin 1；細(xì)胞溶質(zhì)蛋白：Alix和TSG101。另外白蛋白是用于評(píng)估尿液對(duì)外泌體的影響即外泌體純度。實(shí)驗(yàn)表明，從尿液中分離的外泌體相對(duì)均一，沒(méi)有尿液污染，并且含有外泌體特異性標(biāo)記。
 
STEP3
蛋白質(zhì)組學(xué)研究


差異蛋白篩查
外泌體蛋白質(zhì)進(jìn)行LC-MS/MS定性和定量分析，5XFAD組和對(duì)照組之間的88種尿液外泌體蛋白存在顯著差異。與對(duì)照組相比，53種蛋白表達(dá)上調(diào)（比率≥1.2，P值<0.05），27種蛋白表達(dá)下調(diào)（5XFAD組為0.83，P值<0.05）。

聚類分析顯示了具有相似表達(dá)譜的不同層次蛋白質(zhì)簇，18種蛋白質(zhì)是5XFAD組所特有的。相反，在對(duì)照組中僅發(fā)現(xiàn)一種獨(dú)特的蛋白質(zhì)。在這些差異表達(dá)的蛋白質(zhì)中，11種蛋白質(zhì)也是大腦中的細(xì)胞標(biāo)志物，并被選作進(jìn)一步研究。具體而言，至少有30種蛋白質(zhì)被報(bào)道與AD的病理機(jī)制或發(fā)展相關(guān)，而6種被確定為AD生物標(biāo)志物并且有很大潛力被認(rèn)為是AD的候選尿液外泌體生物標(biāo)志物。
蛋白質(zhì)組學(xué)聚類分析和GO分析比較, 根據(jù)差異表達(dá)蛋白和尿液外泌體無(wú)偏聚類分析，對(duì)差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行GO餅圖分析，以研究對(duì)照組和5XFAD小鼠樣本之間的特定MFs、BP和CCs，并根據(jù)不同GO術(shù)語(yǔ)確定的基因數(shù)量進(jìn)行比較。
WB、ELISA和MRM靶向蛋白分析驗(yàn)證差異蛋白
根據(jù)定性和定量分析，在5XFAD組和對(duì)照組之間，有88種尿液外泌體蛋白存在顯著差異。根據(jù)蛋白質(zhì)組學(xué)分析的結(jié)果，共選擇22種蛋白質(zhì)進(jìn)行下一步驗(yàn)證。為了使靶蛋白之間的關(guān)系更加清晰和直觀，進(jìn)行了22種靶蛋白的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)分析和MRM分析。 對(duì)照組和5XFAD小鼠靶蛋白的PPI分析和MRM分析，PPI分析顯示了目標(biāo)差異蛋白之間的關(guān)系。兩種蛋白質(zhì)之間的線越多，相互作用的可能性就越大。MRM測(cè)定了對(duì)照組和5XFAD小鼠之間22種靶蛋白的相對(duì)峰面積。

結(jié)果表明：
FUCA2、Ly86、PrP、Annexin 2和Fuca1在兩組之間存在顯著差異。
WB、ELISA和MRM靶向蛋白分析驗(yàn)證22個(gè)靶蛋白。與對(duì)照組相比，HEXB（溶酶體和/或自噬途徑蛋白）在尿液外泌體蛋白中顯著增加，這與5XFAD小鼠大腦中HEXB的差異表達(dá)一致。

另外四種蛋白質(zhì)，AOAH、Clustrin、Ly86和Preol，表現(xiàn)出相同的趨勢(shì)，在蛋白質(zhì)組和WB分析中存在顯著差異。與對(duì)照組相比，5XFAD組的AOAH水平顯著升高；相反，Clustrin、Ly86和Preol水平明顯降低。
研究結(jié)論

共鑒定出316種蛋白質(zhì)，包括44種腦細(xì)胞標(biāo)志物。重要的是，18種蛋白質(zhì)是5XFAD組所獨(dú)有的。共有88種蛋白質(zhì)（包括11種腦細(xì)胞標(biāo)志物）差異表達(dá)。WB驗(yàn)證進(jìn)一步證實(shí)這些蛋白質(zhì)中有5個(gè)存在顯著差異。

本研究思路清晰，選擇對(duì)照組和模型小鼠樣本，取尿液外泌體樣本，進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，獲得差異表達(dá)蛋白，然后對(duì)篩選的差異蛋白進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果表明一些尿液外泌體蛋白，尤其是Annexin 2和Clusterin能夠檢測(cè)淀粉樣β斑塊沉積前的差異，這可能是預(yù)防AD的理想非侵入性生物標(biāo)志物來(lái)源。

再回顧借鑒此文研究思路





Dr.Cell實(shí)驗(yàn)室根據(jù)研究者的不同需求，提供差異化的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)服務(wù)以及外泌體整體服務(wù)方案。


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參考文獻(xiàn)

Song Z, et al. Comprehensive Proteomic Profiling of Urinary Exosomes and Identification of Potential Non-invasive Early Biomarkers of Alzheimer's Disease in 5XFAD Mouse Model. Front Genet.2020;11:565479.