課題概述

合成代謝是工程細菌的負擔之一，但其內(nèi)部機制并不明晰。本研究結(jié)果表明轉(zhuǎn)錄因子Cra活性失調(diào)導(dǎo)致甘油過量合成是大腸桿菌生長負擔的重要原因。甘油的合成會降低1,6-二磷酸果糖水平并激活Cra，從而抑制糖酵解相關(guān)酶的活性和促進糖異生相關(guān)酶活性。由于細胞生長依賴葡萄糖的供應(yīng)，糖異生過程的不當激活和糖酵解過程的抑制可能會導(dǎo)致甘油通路誘導(dǎo)作用下?lián)p害細胞生長。德國馬克斯·普朗克陸地微生物研究所Hannes Link團隊通過在甘油通路限速酶表達的啟動子中設(shè)計了一個Cra結(jié)合位點以維持足夠高的1,6-二磷酸果糖水平。作者設(shè)計了一組成型的誘導(dǎo)型啟動子，并在大腸桿菌中過量合成了類胡蘿卜素，從而證明了該方法的普適性。相關(guān)成果發(fā)表在《Nature communications》。

1. 甘油過量合成導(dǎo)致大腸桿菌的生長負擔

為了研究合成代謝途徑如何影響宿主的代謝過程，作者在大腸桿菌中過表達甘油生物合成途徑。甘油通路是從糖酵解代謝物磷酸二羥丙酮開始的兩步反應(yīng)。第一步反應(yīng)由3-磷酸甘油脫氫酶(GPD1)催化，將磷酸二羥丙酮轉(zhuǎn)化為3-磷酸甘油。第二步反應(yīng)在3-磷酸甘油磷酸水解酶(GPP2)催化下，3-磷酸甘油去磷酸化生成甘油。用于合成甘油的大腸桿菌菌株從質(zhì)粒中表達了編碼gpd1和gpp2的兩個基因，并缺乏甘油激酶基因(glpK)防止甘油作為碳源被利用。其中gpd1由pBAD啟動子（阿拉伯糖誘導(dǎo)）調(diào)控，而gpp2由pJ23101啟動子調(diào)控。在生長負擔調(diào)控研究中，發(fā)現(xiàn)pBAD啟動子能夠線性促進蛋白表達。然而，根據(jù)通量平衡分析，pBAD啟動子無法調(diào)控生長速率和甘油合成效率。但是，甘油通路誘導(dǎo)作用下，生長速率下降幅度比通量平衡分析要劇烈得多，如圖1所示。

圖1 甘油過量合成導(dǎo)致大腸桿菌的生長負擔

 

2. 甘油合成通過降低1,6-二磷酸果糖水平來激活轉(zhuǎn)錄因子Cra

為探討導(dǎo)致菌株生長負擔的分子機制，作者對0、0.1 和 0.5%阿拉伯糖誘導(dǎo)下的代謝組變化進行分析。共檢測到96種代謝物，這些代謝物在0.1%阿拉伯糖誘導(dǎo)下保持相對恒定，但在0.5%阿拉伯糖誘導(dǎo)時顯示出強烈變化。其中，0.5%阿拉伯糖誘導(dǎo)時，甘油通路的直接前體磷酸二羥丙酮（DHAP）下降最強烈。此外，磷酸二羥丙酮上游代謝物1,6-二磷酸果糖(FBP)也是變化最明顯的代謝物之一。FBP可激活轉(zhuǎn)錄因子Cra，進而抑制糖酵解酶相關(guān)基因表達和促進糖異生酶相關(guān)基因表達。低濃度FBP是否可以激活Cra從而調(diào)控基因表達和酶活性。Cra敲除菌株作為對照組，對各實驗組38個蛋白進行分析，發(fā)現(xiàn)0.5%阿拉伯糖組磷酸烯醇丙酮酸合成酶（PpsA）出現(xiàn)顯著上調(diào)，而甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GapA）顯著降低。由此說明，0.5%阿拉伯糖誘導(dǎo)甘油通路可降低FBP濃度從而激活Cra，導(dǎo)致GapA活性降低（糖酵解相關(guān)酶）、PpsA活性增加（糖異生相關(guān)酶）。

由于菌株在含有低葡萄糖濃度培養(yǎng)基里生長，由此假設(shè)糖異生激活是生長負擔的重要原因，并進行了證實。此外，在甘油通路高誘導(dǎo)下，Cra敲除菌株比基礎(chǔ)菌株生長得更好。因此，Cra可以調(diào)控甘油過量合成造成大腸桿菌的生長負擔。

圖2 甘油通路的誘導(dǎo)激活轉(zhuǎn)錄因子Cra

 

3. 代謝模型預(yù)測甘油合成最優(yōu)策略

為進一步表明Cra轉(zhuǎn)錄是調(diào)控甘油合成的一個因素，作者開發(fā)了一個小型動力學(xué)模型。如圖3所示，該模型包含一種代謝物(1,6-二磷酸果糖)和兩種酶(GapA和GPD1)。根據(jù)Michaelis-Menten動力學(xué)，1,6-二磷酸果糖影響糖酵解和甘油通路的反應(yīng)速率。作者假設(shè)模型中有恒定的流入，并將糖酵解上限反應(yīng)速率固定為4.9 mmol/g/h，意味著1,6-二磷酸果糖以恒定速率合成從而用于甘油合成或者生物物質(zhì)合成。構(gòu)建三個不同的模型（基本模型、Δcra模型、2xcra模型）進行分析，分析結(jié)果顯示2xcra模型最優(yōu)，可獲得高甘油通量。因此，模型分析認為將Cra調(diào)控不同酶活性可能會使甘油合成率增加。

圖3 Cra調(diào)控下的pBAD啟動子促進甘油合成的理論和實驗分析

 

4. Cra調(diào)控的pBAD啟動子可改善生長速率和甘油合成

研究中發(fā)現(xiàn)Cra可抑制pBAD-Cra啟動子，為證明pBAD-Cra啟動子功能，檢測野生型和Δcra菌株中pBAD啟動子和pBAD-Cra啟動子活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，野生型菌株中，pBAD-Cra啟動子活性低于pBAD啟動子，說明Cra對啟動子有抑制作用。而在Δcra菌株中，pBAD-Cra啟動子的活性略高于pBAD啟動子。這些結(jié)果表明Cra抑制pBAD-Cra啟動子，而這種調(diào)控作用在沒有Cra存在的情況下不發(fā)揮作用。因此，pBAD-Cra的低活性并不僅僅是因為序列改變，而是由于Cra主動抑制。

圖4 Cra對pBAD啟動子的調(diào)控作用

 

5. 高甘油通量下Cra調(diào)控pBAD啟動子維持高1,6-二磷酸果糖水平

為了深入探討Cra調(diào)控的動態(tài)規(guī)律，作者考察了甘油通路誘導(dǎo)下代謝組和蛋白質(zhì)組的變化情況。如圖5所示，pBAD-Cra菌株可以在較高的甘油合成速率下維持較高的1,6-二磷酸果糖水平。這表明1,6-二磷酸果糖和Cra之間的相互作用抵消了1,6-二磷酸果糖的下降趨勢。其一，如果1,6-二酸果糖水平低于臨界值則Cra活性增加；其二，過高的Cra活性會抑制pBAD-Cra啟動子活性并抑制GPD1表達；其三，GDP1過低表達將恢復(fù)1,6-二磷酸果糖最初的濃度。因此，這種反饋調(diào)節(jié)機制不僅使1,6-二磷酸果糖維持在較高水平，提高甘油合成速率，而且能阻止大腸桿菌從糖酵解到糖異生的代謝轉(zhuǎn)變。

圖5 甘油通路誘導(dǎo)的代謝物和蛋白質(zhì)含量變化情況

 

6. Cra調(diào)控促進類胡蘿卜素過表達型大腸桿菌的生長

由于很多生物物質(zhì)合成以糖降解代謝物為前體，為考察該調(diào)控機制的普適性，作者利用pBAD啟動子來調(diào)控類胡蘿卜素合成與代謝途徑（如圖6所示）。類胡蘿卜素生物合成從糖酵解代謝產(chǎn)物丙酮酸和3-磷酸甘油醛開始，通過大腸桿菌的甲基赤蘚醇磷酸化途徑轉(zhuǎn)化為法尼基焦磷酸，法尼基焦磷酸進一步轉(zhuǎn)化為類胡蘿卜素。甲基赤蘚醇磷酸途徑兩種酶(Dxs和Dxr)是從質(zhì)粒中過度表達的兩種pBAD啟動子，分別稱為pController和pController-Cra。類胡蘿卜素途徑的其它酶(CrtE/B/I/Y/Z)由另一個質(zhì)粒(p胡蘿卜素)利用擬南芥原生啟動子進行表達。結(jié)果顯示Cra調(diào)節(jié)的啟動子在合成類胡蘿卜素途徑高誘導(dǎo)水平下可以維持更高的生長速度，并且高誘導(dǎo)劑不影響細胞生長和生成速率。這表明，Cra調(diào)控的pBAD啟動子具有廣泛的普適性，通過糖酵解代謝物調(diào)控其他合成途徑成為可能。

圖6 Cra調(diào)控的pBAD啟動子可促進類胡蘿卜素的大量合成

 

總結(jié)

本研究中，作者使用阿拉伯糖誘導(dǎo)的pBAD啟動子來調(diào)控大腸桿菌的合成代謝途徑。雖然在GFP表達的情況下，pBAD啟動子顯示出誘導(dǎo)劑濃度和表達率之間具有線性關(guān)系，但沒有觀察到甘油過量產(chǎn)生。在該情況下，誘導(dǎo)劑少量增加就可造成巨大的生長負擔且合成效率降低，最終導(dǎo)致包括甘油在內(nèi)的各生物活性成分濃度降低。研究者通過代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)來探討了Cra對pBAD啟動子調(diào)控及宿主代謝水平的影響。從生物技術(shù)前景來看，該方法將有助于改良菌株合成技術(shù)，使其能夠有效應(yīng)對工業(yè)規(guī)模生物反應(yīng)器等外部干擾和基因表達等內(nèi)部干擾。

參考文獻

Chun-Ying Wang, et al. Metabolome and proteome analyses reveal transcriptional misregulation in glycolysis of engineered E. coli. Nature Communications . 2021. https://doi.org/10.1038/s41467-021-25142-0.

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特約作者

張定坤，四川大學(xué)華西醫(yī)院助理研究員兼博士后，研究方向為代謝組學(xué)。

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