多不飽和游離脂肪酸（FFA）如花生四烯酸等，主要由膜磷脂上的磷脂酶活性釋放，長期以來被認(rèn)為對學(xué)習(xí)和記憶有益，并且是機(jī)體神經(jīng)傳遞和突觸可塑性調(diào)節(jié)劑。然而，在學(xué)習(xí)過程中大腦特定區(qū)域的其他 FFA 和磷脂變化的確切機(jī)制尚不清楚。昆士蘭大學(xué)腦研究所Frédéric A. Meunier團(tuán)隊采用FFAs的敏感同位素標(biāo)記多重分析（FFAST）和靶向脂質(zhì)組學(xué)方法來表征大鼠大腦中的 FFA 和磷脂，以探討磷脂衍生的 FFA 增加在學(xué)習(xí)和記憶形成中所起的作用。

磷脂和游離脂肪酸在大鼠腦內(nèi)分布不均勻

分別采用兩種互補的脂質(zhì)組學(xué)技術(shù)檢測大鼠腦組織中磷脂和 FFA 的變化。FFAST 使用微分穩(wěn)定同位素標(biāo)記法標(biāo)記 FFA 的羧基，對大鼠大腦 6 個區(qū)域的 18 種FFA進(jìn)行靶向定量獲得 FFA 濃度（pmol/mg）；在磷脂分析方面，使用負(fù)離子模式ESI-MS，將磷脂生成前體離子sn-1/sn-2酰基片段。用冷的人工腦脊液灌注以減少缺血和死后脂質(zhì)代謝，從解剖組織（中央杏仁核、基底外側(cè)杏仁核、前額葉皮層、腹側(cè)海馬、背側(cè)海馬和小腦）中分別提取 FFA 和磷脂并進(jìn)行獨立分析（圖 1a-b）。堆積條形圖展示了 FFA 和 5 類磷脂（磷脂酸-PA、磷脂酰膽堿-PC、磷脂酰乙醇胺-PE、磷脂酰甘油-PG 和磷脂酰絲氨酸-PS）的平均濃度（圖 1d-i）。結(jié)果表明，F(xiàn)FAs和磷脂在大腦區(qū)域中分布不均；相對于組織重量，杏仁核和前額皮質(zhì)的濃度最高，海馬背側(cè)和小腦的濃度最低。飽和FFAs（6:0–24:0）占大腦各區(qū)域FFAs的絕大部分，其中PC和PE在整個大腦中的含量最高。

（圖1）

磷脂和FFAs對聯(lián)想學(xué)習(xí)有反應(yīng)

杏仁核中磷脂和FFA的豐度非常高，提示其可能參與杏仁核有關(guān)的學(xué)習(xí)和記憶獲取。通過研究脂質(zhì)對聽覺恐懼條件反射（AFC）的反應(yīng)來探索這種可能性。AFC 是一種廣泛使用的學(xué)習(xí)范式，在這種范式中，動物學(xué)會將中性聽覺音調(diào)與輕度電擊聯(lián)系起來。暴露于配對音調(diào)/電擊 AFC 刺激的大鼠對隨后的僅音調(diào)刺激表現(xiàn)出明顯的凍結(jié)（圖2a-b），對照組大鼠暴露在相同數(shù)量的未配對音調(diào)中。作者試圖確定這種長期學(xué)習(xí)行為是否與動物大腦（尤其是杏仁核）中脂質(zhì)結(jié)構(gòu)變化有關(guān)。N-甲基天冬氨酸（NMDA）受體在恐懼學(xué)習(xí)中至關(guān)重要，競爭性NMDA受體拮抗劑（6）-3-（2-羧基哌嗪-4-yl）丙基-1-膦酸（CPP）通常被用于阻斷聯(lián)想學(xué)習(xí)。作者測試了與鹽水注射的動物相比，用CPP阻斷NMDA受體是否改變對AFC的脂質(zhì)反應(yīng)。通過比較四個隊列動物的脂質(zhì)組譜（圖2a）以評估FFA和磷脂對AFC的反應(yīng)，當(dāng)CPP阻斷長期恐懼記憶獲取時，這種活性依賴的反應(yīng)是如何被調(diào)節(jié)的，從而識別出豐度變化與 NMDA 依賴的長期記憶相關(guān)的脂質(zhì)種類。在全腦水平上，AFC與生理鹽水注射導(dǎo)致許多FFA顯著增加（飽和肉豆蔻酸增加最顯著），大量磷脂的顯著減少（圖2c）。在CPP條件下配對AFC的特征是FFAs和磷脂的減少（圖2d）。在生理鹽水處理的動物中，AFC導(dǎo)致FFAs顯著增加，PG略有增加，PA、PC、PE和PS均減少（圖2d）。相比之下，在CPP處理的動物中，AFC在所有類別中均呈減少趨勢。

（圖2）

層次聚類熱圖（圖3a）顯示FFAs和特定類別的磷脂聚在一起，表明對AFC的反應(yīng)相似，F(xiàn)FAs在整個大腦中呈增加趨勢，在中央杏仁核觀察到最強(qiáng)的影響，肉豆蔻酸的影響最強(qiáng)；腹側(cè)海馬的 PA 和 PC 水平顯著降低，而中央和基底外側(cè)杏仁核的 PE 水平降低，腹側(cè)海馬的 PG 水平增加，前額葉皮層中的所有脂質(zhì)類別均略有增加（圖 3a-b，框1-5）。CPP可調(diào)節(jié)這些反應(yīng)，但其作用在中央杏仁核和海馬背側(cè)最為顯著，其中大多數(shù)被檢測的脂質(zhì)豐度顯著減少。盡管 CPP 本身會影響整個大腦中 FFAs 的基礎(chǔ)水平，但這些變化與響應(yīng)活動的區(qū)域特異性CPP效應(yīng)無關(guān)。

（圖3）

FFA反應(yīng)與長期恐懼記憶的形成相關(guān)

如圖2和3所示，F(xiàn)FAs（特別是飽和肉豆蔻酸和棕櫚酸）對AFC的響應(yīng)表現(xiàn)出最顯著的活性依賴性變化。本研究使用AFC能夠確定這些大腦特定區(qū)域?qū)�FFA譜的改變是否與對恐懼條件反射的持久學(xué)習(xí)反應(yīng)相關(guān)。在 AFC 之后0 小時和幾小時（圖 2b），生理鹽水和 CPP 處理的動物通常僅對音調(diào)的刺激表現(xiàn)出非常相似的凍結(jié)反應(yīng)，這表明在不依賴NMDA受體的方式下，對配對刺激獲得了相同的短期學(xué)習(xí)反應(yīng)。然而，隨后的恐懼記憶鞏固是 NMDA 受體依賴性的，因為它可以被CPP 阻斷。AFC 后 24 小時（圖 2b），生理鹽水處理的動物保持對音調(diào)的凍結(jié)反應(yīng)，而 CPP 處理的動物則表現(xiàn)出顯著減弱的反應(yīng)。在 AFC 后 2 小時測定脂質(zhì)，此時 FFA 對配對 AFC 刺激的反應(yīng)在生理鹽水和 CPP 處理的動物之間始終不同，即使兩組在此階段表現(xiàn)出相似的凍結(jié)行為，表明由對 AFC 的短期反應(yīng)引起的大腦 FFA 譜的變化是鞏固長期記憶所必需的。通過抑制 NMDA 受體來阻止這些特征變化與記憶鞏固失敗相關(guān)。為了確認(rèn)FFA反應(yīng)的定量變化與記憶獲取的關(guān)系，本研究使用多元分析評估了4個實驗條件下6個腦區(qū)24個樣本獲得的FFA譜的關(guān)系，3456個個體FFA測量值被壓縮成一個18 FFA x 24的陣列，每個陣列元素代表8只大鼠FFA的平均測量值。使用 isomap 算法通過非線性降維 (NLDR) 對陣列進(jìn)行分析，結(jié)果證實FFA對CPP處理和AFC刺激的廣泛響應(yīng)， NLDR 根據(jù)四種實驗條件可以很容易地對配置文件進(jìn)行分組，這與長期記憶鞏固相關(guān)（圖 2b）。

FFA對AFC的反應(yīng)在杏仁核最強(qiáng)

生理鹽水和 CPP 處理的動物中， FFA 對 AFC 的反應(yīng)在杏仁核尤其是中央杏仁核最為顯著（圖 4a-b），主要是飽和的 FFA，特別是肉豆蔻酸及棕櫚酸�；ㄉ�四烯酸是反應(yīng)最強(qiáng)烈的不飽和 FFA。本研究中使用的6-8 周代表青春期中后期雄性動物，已有研究表明青春期對負(fù)面事件的情緒反應(yīng)會增強(qiáng)；與成年鼠相比，青春期鼠因恐懼而產(chǎn)生凍結(jié)行為的消失程度大大降低。本研究中觀察到的杏仁核中FFA反應(yīng)增高可能至少部分反映了青春期雄性鼠的發(fā)育過程。雖然推測 FFA 的增加與 AFC 突觸中磷脂酶活性導(dǎo)致的磷脂減少相關(guān)，但磷脂在腦組織中的濃度遠(yuǎn)高于 FFA，給定的 FFA 種類可能來自多種磷脂和其他底物（如溶血磷脂和�；�甘油）的酶促加工。當(dāng)對測量的磷脂類別中最常見的�；�種類求和時（圖 4c），F(xiàn)FA 酰基種類的分布并不簡單地反映特定磷脂分類中�；�種類的分布，也不能反映總磷脂的分布，提示在記憶獲取過程中會出現(xiàn)某種程度的磷脂酶特異性，尤其是游離肉豆蔻酸的相對豐度高，而含肉豆蔻酰基的磷脂相對豐度低（圖 4c）。值得注意的是，在中央杏仁核中，PA/PC/PS 磷脂中20:4_14:0，22:6_14:0 和 16:0_14:0 減少（圖 3a）。相反，游離棕櫚酸并不反映其在磷脂，尤其是磷脂酰膽堿中的相對豐度高，且磷脂底物加工具有很強(qiáng)的大腦區(qū)域特異性。整個大腦中肉豆蔻酸活性依賴性增加，并不是反映到這些區(qū)域中含有肉豆蔻�；�的磷脂底物的補充性減少（圖 4d）。

（圖4）

小結(jié)

本研究將脂質(zhì)組學(xué)方法與AFC 結(jié)合闡述：（1）磷脂和 FFA 在大鼠大腦中的分布是異質(zhì)的，在杏仁核中濃度最高；（2）磷脂和 FFA 分布在整個大腦中發(fā)生變化以活動依賴的方式響應(yīng) AFC；（3）變化特征是飽和脂肪酸（特別是肉豆蔻酸）和較低程度的不飽和脂肪酸（特別是花生四烯酸）可能從磷脂底物中釋放；（4）用NMDA受體拮抗劑CPP阻斷這些變化與長期記憶鞏固失敗有關(guān)，但對AFC的短期反應(yīng)并無影響。以上結(jié)果表明由NMDA受體調(diào)控的FFA變化是學(xué)習(xí)和記憶形成所必需的。大腦區(qū)域特異性的FFA對AFC最大的反應(yīng)在杏仁核和前額皮質(zhì)，前腦的前額皮質(zhì)對AFC的反應(yīng)第二大，高于海馬體。

本研究將FFA 譜與腦功能建立聯(lián)系并解析全腦FFA隨學(xué)習(xí)變化的輪廓，明確了進(jìn)一步研究磷脂及其代謝物在記憶形成的重要意義。在獲取恐懼記憶過程中產(chǎn)生的特定飽和/不飽和的FFAs與該記憶的長期鞏固相關(guān)，但FFAs介導(dǎo)這種鞏固的機(jī)制目前仍不清楚。將脂質(zhì)組學(xué)技術(shù)的新發(fā)展與動物學(xué)習(xí)和記憶模型相結(jié)合，對于揭示這些FFAs在學(xué)習(xí)和記憶中的具體作用至關(guān)重要。

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參考文獻(xiàn)

Tristan P. Wallis, Frédéric A. Meunier, et al. Saturated free fatty acids and association with memory formation. Nature Communications. 2021. https://doi.org/10.1038/s41467-021-23840-3.

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