接下來(lái)，為了研究纖連蛋白水平與乳腺癌腫瘤惡性程度之間的依賴性，通過(guò)高度惡性MDA-MB-231和低度惡性MCF-7細(xì)胞的western印跡測(cè)試?yán)w連蛋白。如圖4a，b所示，纖維連接蛋白的表達(dá)與乳腺癌的惡性程度呈正相關(guān)。因此，通過(guò)纖維連接蛋白結(jié)合肽的修飾，SQ1納米探針可以用來(lái)靶向纖維連接蛋白，并根據(jù)乳腺癌腫瘤中纖維連接蛋白水平的差異來(lái)識(shí)別高危乳腺癌。

為了生物相容性的考慮，用CCK8檢測(cè)與SQ1納米探針?lè)跤�的MDA-MB231細(xì)胞的存活率。SQ1納米探針顯示出較低的細(xì)胞毒性，在與SQ1納米探針(0−512μg/mL)孵育24小時(shí)后，80%以上的細(xì)胞仍然存活(圖4d)。因此，SQ1納米探針是一種生物相容性顯像劑。最終，超過(guò)80%的MDA-MB-231細(xì)胞被SQ1納米探針介導(dǎo)的光熱效應(yīng)殺死。SQ1納米探針(0.5 mg/mL)和近紅外激光(0.5W/cm2)預(yù)處理的MDA-MB-231細(xì)胞幾乎全部顯示SQ1納米探針能有效地在體外光熱殺滅腫瘤細(xì)胞。

圖5：SQ1納米探針的體內(nèi)成像特性，(A)靜脈注射SQ1納米探針10分鐘后，對(duì)小鼠血管進(jìn)行近紅外成像(NIR-II)，(b，c)兩個(gè)區(qū)(ROI 1和ROI 2)放大的后肢NIR-II圖像，(d，e)ROI1和ROI2后肢紅線的熒光強(qiáng)度，(F)靜脈注射SQ1納米探針或SQ1@DSPE(對(duì)照)后0、1、2、6、12和24小時(shí)，對(duì)陽(yáng)性的MDA-MB-231腫瘤進(jìn)行NIR-II顯像，(G)在NIR-II顯像后同時(shí)進(jìn)行腫瘤PA顯像，比例尺是2mm

 

緊接著，為了顯示近紅外-II成像在血管造影中的優(yōu)點(diǎn)，靜脈注射SQ1100−納米探針(100μL，100μg)后，用近紅外-II成像技術(shù)在1000mm1100 nm區(qū)域?qū)π∈笱�管進(jìn)行成像。NIR-II成像可以清楚地顯示第二個(gè)窗口中由于組織穿透增加而導(dǎo)致的皮膚下血管的分布(圖5a)。高倍率的NIR-II圖像可以清楚地顯示通過(guò)小鼠后肢動(dòng)脈的血液流動(dòng)(圖5b，c)。提示NIR-II成像適用于血管造影(圖5d，e)。這些結(jié)果表明，使用SQ1納米探針進(jìn)行血管造影的NIR-II成像是可行的。

然后為了研究SQ1納米探針在小鼠體內(nèi)的近紅外成像能力，分別對(duì)SQ1納米探針(100μL，100μg)和非靶向SQ1@DSPE(100μL，100μg)進(jìn)行了研究。如圖5f所示，對(duì)于注射SQ1納米探針的小鼠，腫瘤內(nèi)的NIR-II成像信號(hào)顯著增強(qiáng)，注射SQ1@DSPE的小鼠腫瘤區(qū)域的熒光增強(qiáng)要弱得多。

如NIR-II和PA成像所示，SQ1納米探針可以很好地累積到MDA-MB-231腫瘤中，這主要是由于SQ1納米探針的有效主動(dòng)靶向，而SQ1@DSPE通過(guò)被動(dòng)靶向攝入腫瘤。這些結(jié)果表明SQ1納米探針具有顯著的腫瘤靶向成像能力。NIR-II/PA雙峰成像顯示靶向肽修飾的SQ1納米探針可以特異性結(jié)合纖連蛋白陽(yáng)性乳腺癌腫瘤。這清楚地表明SQ1納米探針可以準(zhǔn)確地檢測(cè)和表達(dá)纖維連接蛋白陽(yáng)性乳腺癌的腫瘤病變。

圖6：使用SQ1納米探針對(duì)乳腺癌肺轉(zhuǎn)移小鼠的NIR-II成像，(a，b)靜脈注射SQ1納米探針后12h，(A)荷肺轉(zhuǎn)移瘤小鼠和(B)正常小鼠的NIR-II顯像，(C)肺轉(zhuǎn)移小鼠和(D)正常小鼠全身NIR-II成像后的器官的體外NIR-II成像，(E)肺轉(zhuǎn)移小鼠和(F)正常小鼠肺切片經(jīng)NIR-II成像后進(jìn)行(e，f)H&E組織化學(xué)分析，比例尺為200μm
 

為了進(jìn)一步評(píng)估SQ1納米探針定位乳腺癌轉(zhuǎn)移性肺部病變的能力。與正常小鼠相比，攜帶肺轉(zhuǎn)移的小鼠的肺顯示增強(qiáng)的NIR-II熒光信號(hào)，表明SQ1納米探針可以選擇性地靶向乳腺癌的肺轉(zhuǎn)移病灶（圖6a，b）且發(fā)現(xiàn)患有轉(zhuǎn)移性乳腺癌的小鼠的肺確實(shí)顯示出增加的信號(hào)，表明SQ1納米探針在肺轉(zhuǎn)移模型中的腫瘤特異性靶向能力（圖6c，d）。如圖6e，f所示，攜帶轉(zhuǎn)移性腫瘤的小鼠肺中的多個(gè)病變顯示肺切片中存在浸潤(rùn)性腫瘤細(xì)胞，這進(jìn)一步證實(shí)SQ1納米探針能夠通過(guò)深度穿透來(lái)解決乳腺癌的肺轉(zhuǎn)移。

圖7：使用SQ1納米探針(SQ1NP)對(duì)小鼠乳腺癌腫瘤進(jìn)行熱成像和PTT，(A)注射PBS或SQ1NP加激光治療后腫瘤的熱成像。(B)光熱治療過(guò)程中腫瘤的溫度變化，(C)腫瘤生長(zhǎng)曲線；(D)治療期間小鼠生長(zhǎng)曲線，(E)PBS、PBS+L、SQ1NP、SQ1NP+L治療后解剖腫瘤重量，標(biāo)尺為50μm。

 

最后，SQ1納米探針具有良好的腫瘤靶向性和良好的體外治療效果，進(jìn)一步促進(jìn)了對(duì)乳腺癌光熱治療的體內(nèi)評(píng)價(jià)。如圖7a，b所示，注射SQ1納米探針的小鼠的腫瘤溫度從33.2°C迅速上升到59.1°C，而PBS預(yù)處理的腫瘤溫度沒(méi)有明顯變化。這些結(jié)果證實(shí)了SQ1納米探針在近紅外輻射下確實(shí)能誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生顯著的熱變化。為驗(yàn)證其光熱治療效果，對(duì)MDAMB-231乳腺癌荷瘤小鼠分別治療，如圖7c所示，隨著時(shí)間的推移，腫瘤體積的這些差異變得更加明顯。此外，小鼠的體重變化與H&E組織化學(xué)分析顯示SQ1納米探針在近紅外激光照射下對(duì)乳腺癌腫瘤有明顯的光熱損傷作用，具有較高的光熱治療效率。

結(jié)論：通過(guò)合理的D-A-D工程，合成了一種發(fā)射延伸至第二窗口的方堿染料。方酸染料SQ1通過(guò)簡(jiǎn)單的納米沉淀和靶向多肽修飾可以被包裹成SQ1納米探針，顯示出NIR-II/PA雙峰成像能力和良好的光熱效應(yīng)。小鼠的NIR-II顯像表明，SQ1納米探針適合于血管造影和腫瘤靶向顯像，尤其是肺轉(zhuǎn)移灶。此外，SQ1納米探針利用在近紅外輻射下優(yōu)異的光熱轉(zhuǎn)換能力，在實(shí)體腫瘤的PA成像和PTT中都表現(xiàn)良好。考慮到它在NIR-II區(qū)域的治療學(xué)的固有優(yōu)勢(shì)，基于方酸的治療納米探針將啟發(fā)其他轉(zhuǎn)移性乳腺癌的創(chuàng)新設(shè)計(jì)。

 

參考文獻(xiàn)

⭐️ ⭐️ ⭐️

近紅外二區(qū)小動(dòng)物活體熒光成像系統(tǒng) - MARS 

NIR-II in vivo imaging system 

高靈敏度 - 采用Princeton Instruments深制冷相機(jī)，活體穿透深度高于15mm

高分辨率 - 定制高分辨大光圈紅外鏡頭，空間分辨率優(yōu)于3um

熒光壽命 - 分辨率優(yōu)于 5us

高速采集 - 速度優(yōu)于1000fps （幀每秒）

多模態(tài)系統(tǒng) - 可擴(kuò)展X射線輻照、熒光壽命、一區(qū)熒光成像、原位成像光譜，CT等

顯微鏡 - 近紅外二區(qū)高分辨顯微系統(tǒng)，兼容成像型光譜儀