基因編輯小鼠模型是當(dāng)今研究基因功能和致病機(jī)制的利器。業(yè)界重量級(jí)資深技術(shù)大咖為您詳細(xì)解析：為何應(yīng)充分了解與關(guān)注基因編輯小鼠模型應(yīng)用中存在的某些風(fēng)險(xiǎn)與影響因素，如何設(shè)計(jì)有助于提升基因編輯小鼠模型研究結(jié)果的準(zhǔn)確性與可靠性。精彩好文，全是干貨，不可錯(cuò)過(guò)！

作者簡(jiǎn)介：
 

俞曉峰 博士
賽業(yè)生物首席科學(xué)家、副總裁

俞曉峰博士現(xiàn)為賽業(yè)生物首席科學(xué)家與副總裁，負(fù)責(zé)基因修飾模式動(dòng)物的研發(fā)與技術(shù)服務(wù)等。俞博士在基因修飾模式動(dòng)物領(lǐng)域有超過(guò)20年以上研發(fā)與管理等方面的豐富經(jīng)驗(yàn)，在干細(xì)胞相關(guān)領(lǐng)域及哺乳動(dòng)物細(xì)胞系基因改造研究也取得了巨大成就，其研究成果多次發(fā)表在Nature Immunology、Hum Mol Genet.、Mol Cell Biol.等高水平雜志上。

加入賽業(yè)生物前，俞博士于2010-2013年任職于美國(guó)應(yīng)用干細(xì)胞（ASC）公司，擔(dān)任研發(fā)總監(jiān)，負(fù)責(zé)基因修飾模式動(dòng)物的研發(fā)與定制服務(wù)，并任中國(guó)子公司斯坦福生物科技公司副總裁。2009-2010年任紐約大學(xué)醫(yī)學(xué)院研究員。2003-2009年任職于美國(guó)基因打靶公司（iTL），作為資深科學(xué)家和項(xiàng)目經(jīng)理，負(fù)責(zé)及參與基因修飾小鼠模型研發(fā)與定制技術(shù)服務(wù)的策略與方案設(shè)計(jì)、項(xiàng)目管理、技術(shù)人員指導(dǎo)與培訓(xùn)、客戶服務(wù)與技術(shù)咨詢等工作，2007年負(fù)責(zé)開(kāi)發(fā)了人源化p53基因突變的腫瘤小鼠模型庫(kù)構(gòu)建項(xiàng)目。2000年任美國(guó)耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院研究員。1995年獲得軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院博士學(xué)位。

前言
應(yīng)用基因編輯小鼠模型研究基因的功能、揭示疾病致病機(jī)制過(guò)程，為藥物研發(fā)的臨床前研究，發(fā)揮了不可取代的作用。而Cre-loxP位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)（簡(jiǎn)稱(chēng)Cre-loxP重組系統(tǒng)）的建立，為完善基因編輯小鼠模型的構(gòu)建，進(jìn)一步開(kāi)展條件性靶基因功能的研究，提供了有效工具。回顧Cre-loxP重組系統(tǒng)在小鼠研究中的實(shí)際應(yīng)用，研究者們認(rèn)識(shí)到，對(duì)該技術(shù)應(yīng)用中存在的某些風(fēng)險(xiǎn)與影響因素，給予充分了解與關(guān)注，將有助于提升靶基因編輯小鼠模型研究結(jié)果的準(zhǔn)確性與可靠性。

一、Cre-loxP位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)應(yīng)用基本原理
所謂Cre-loxP位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)，源于噬菌體P1中，存在Cre重組酶（343個(gè)氨基酸蛋白，4個(gè)亞單位組成）及其能特異識(shí)別的一對(duì)34 bp的DNA序列（即loxP位點(diǎn)），并根據(jù)兩個(gè)loxP位點(diǎn)的方向性，將兩loxP位點(diǎn)之間的DNA序列（也稱(chēng)floxed區(qū)域）進(jìn)行特異性重組切割或反轉(zhuǎn)。

如果在相應(yīng)細(xì)胞/組織內(nèi)特異性表達(dá)Cre重組酶,  且細(xì)胞/組織內(nèi)也含兩個(gè)loxP位點(diǎn)序列的floxed靶區(qū)域，則可使Cre-loxP系統(tǒng)的重組作用，局限于特定細(xì)胞或組織，實(shí)現(xiàn)體內(nèi)靶基因特異性敲除或表達(dá)的目的。 T細(xì)胞特異性Cre轉(zhuǎn)基因小鼠最先構(gòu)建，為條件性靶基因在T細(xì)胞中的功能研究提供了條件。

二、應(yīng)用Cre-loxP位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)小鼠條件性靶基因功能研究
要想實(shí)現(xiàn)小鼠條件性靶基因編輯及功能相關(guān)研究，前提是分別獲得兩種小鼠模型：即構(gòu)建含兩個(gè)loxP位點(diǎn)序列floxed靶基因的小鼠和細(xì)胞/組織特異性表達(dá)Cre小鼠。比如，為了開(kāi)展某靶基因的條件性敲除（CKO)研究, 首先要構(gòu)建該靶基因的打靶載體，即將兩個(gè)loxP位點(diǎn)分別克隆到該靶基因DNA區(qū)域的兩端，再借助CRISPR/Cas 受精卵注射或賽業(yè)生物TurboKnockout囊胚注射技術(shù)，建立所謂的靶基因floxed小鼠，即小鼠模型在某靶基因計(jì)劃敲除的特定floxed區(qū)域，已經(jīng)攜帶了兩個(gè)同向的loxP位點(diǎn)。將該floxed小鼠與某特定細(xì)胞/組織特異性表達(dá)的Cre小鼠進(jìn)行交配，就能獲得該靶基因在此特定細(xì)胞/組織敲除的小鼠模型。

最終完成Cre-loxP系統(tǒng)條件性靶基因編輯小鼠研制的操作，通常需要通過(guò)floxed小鼠與相應(yīng)Cre小鼠間的兩步遺傳交配繁殖過(guò)程。第一步交配，X基因Cre雜合小鼠（X基因Cre/+）與Y基因 floxed雜合小鼠（Y基因 lox/+，即CKO打靶Y基因)，或Y基因 floxed純合小鼠（Y基因lox/lox）交配，獲得X基因Cre/+; Y基因lox/+ 后代雜合小鼠。第二步交配，將X基因Cre/+; Y基因lox/+雜合小鼠，再與Y基因lox/+雜合小鼠，或Y基因lox/lox純合小鼠交配，從而獲得最終X基因Cre/+；Y基因lox/lox條件性打靶小鼠。

如果Cre表達(dá)是嚴(yán)格調(diào)控的，且無(wú)生殖系統(tǒng)或發(fā)育過(guò)程表達(dá)現(xiàn)象，第二步交配的后代小鼠, 只有X基因Cre/+; Y基因lox/lox小鼠，可作為條件性靶基因打靶的小鼠模型研究，即Y基因的兩個(gè)等位基因，在Cre重組酶特異性表達(dá)活性的組織細(xì)胞中，被有效重組切割的目的。

然而，如果Cre存在生殖系統(tǒng)泄露表達(dá)情況，在第一步交配后，有可能對(duì)X基因Cre/+; Y基因lox/+雜合小鼠，進(jìn)行生殖性重組切割作用，產(chǎn)生X基因Cre/+; Y基因Δ/+小鼠（Δ代表Y基因某個(gè)等位基因在某些細(xì)胞或所有細(xì)胞敲除），這樣的話，第二步交配，就是X基因Cre/+; Y基因Δ/+雜合小鼠，與Y基因lox/+雜合小鼠，或Y基因lox/lox純合小鼠進(jìn)行交配。如果此時(shí)，還是用常規(guī)兩個(gè)引物的PCR鑒定策略，很難鑒別出非預(yù)期的生殖系基因敲除現(xiàn)象，必需借助設(shè)計(jì)三個(gè)引物組合的PCR鑒定策略加以確定。

三、不同Cre小鼠模型構(gòu)建策略及方法特點(diǎn)
目前有四種常見(jiàn)Cre小鼠模型構(gòu)建策略及方法，雖然每種方法都有其優(yōu)勢(shì)與不足，也很難說(shuō)那種策略方法，能夠適合或滿足所有研究目的。所以，最終選擇哪種方法，還是要根據(jù)研究目的具體情況決定。

1. 質(zhì)粒表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因Cre小鼠模型：認(rèn)為是Cre小鼠構(gòu)建的傳統(tǒng)方法，因?yàn)樽畛醯?/span>Cre小鼠模型，多是應(yīng)用特定啟動(dòng)子加Cre基因cDNA的質(zhì)粒載體，通過(guò)受精卵原核注射法，獲得Cre隨機(jī)插入基因組的轉(zhuǎn)基因小鼠。

由于啟動(dòng)子大小的限制，只選擇了一定范圍的表達(dá)調(diào)控元件序列，構(gòu)建Cre表達(dá)載體，加上轉(zhuǎn)基因隨機(jī)插入基因組的位置效應(yīng)影響、拷貝數(shù)的差異、以及內(nèi)源基因可能破壞等因素，使每個(gè)Cre首建鼠存在個(gè)體差異，且需要通過(guò)對(duì)每個(gè)首建鼠特征進(jìn)行篩選與鑒定，獲得特定理想的Cre轉(zhuǎn)基因小鼠模型。 因此，通過(guò)傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建的Cre小鼠模型，出現(xiàn)所謂Cre作用的“脫靶（off-target）” 活性，也就不奇怪了。

2. 定點(diǎn)敲入Cre小鼠模型：將Cre基因定點(diǎn)敲入相關(guān)內(nèi)源基因位點(diǎn)，借助內(nèi)源性基因調(diào)控序列確定Cre表達(dá)特征，已成為傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因Cre小鼠構(gòu)建的替代選擇，也增加了Cre基因表達(dá)活性的精確性。

應(yīng)用CRISPR/Cas或賽業(yè)生物TurboKnockout的ES打靶技術(shù)方法，將單拷貝Cre定點(diǎn)敲入相關(guān)內(nèi)源基因位點(diǎn)，按以下幾種策略方式敲入：（1）. 特定內(nèi)源基因翻譯啟始位點(diǎn); （2）. 借助IRES序列連接，將Cre基因敲入內(nèi)源基因的3’ UTR區(qū)域；（3）. 借助2A“自切割”肽連接，將Cre基因替換并敲入內(nèi)源基因的終止密碼處。

一般而言，直接將Cre敲入特定內(nèi)源基因的翻譯啟始位點(diǎn)的策略，往往會(huì)同時(shí)破壞了該基因的表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn)，因Cre敲入到生長(zhǎng)發(fā)育或疾病通路等至關(guān)重要相關(guān)基因中，導(dǎo)致相應(yīng)Cre小鼠，出現(xiàn)影響基因功能的潛在非特異性表型。比如，Foxg1-Cre敲入小鼠模型，雜合Cre小鼠即出現(xiàn)小鼠前腦發(fā)育障礙。所以，該策略只適合于哪些雜合缺失無(wú)表型的相關(guān)基因。而應(yīng)用IRES和2A敲入策略，避免了由Cre特定位點(diǎn)敲入，可能引起的雜合缺失表型的不足。

關(guān)于IRES與2A肽兩種連接敲入策略的比較，通常認(rèn)識(shí)是，傳統(tǒng)的IRES敲入策略，幾乎不會(huì)影響內(nèi)源基因的功能，但也發(fā)現(xiàn)，由于傳統(tǒng)經(jīng)典的ES打靶過(guò)程中，Neo基因表達(dá)成分，或去除其后遺留的相關(guān)FRT序列等遺留部分序列，可能會(huì)引起內(nèi)源基因3’ UTR區(qū)域結(jié)構(gòu)改變，從而干擾了Cre的表達(dá)水平，使其實(shí)際表達(dá)量會(huì)相對(duì)低于內(nèi)源基因本身。而新型2A肽連接敲入方式，Cre表達(dá)量與其內(nèi)源基因表達(dá)幾乎相似，但由于切割2A肽后，遺留的約17-21氨基酸序列，可以附著于內(nèi)源基因c-端蛋白，存在潛在影響內(nèi)源蛋白功能的可能性。已有研究表明，不同的2A肽序列 (P2A, T2A, E2A, F2A) 具有不同自切割效率。 盡管如此，應(yīng)用敲入3'端策略，已不斷贏得其吸引力。

3. BAC轉(zhuǎn)基因Cre小鼠模型：將Cre基因先敲入至BAC克隆的特定基因調(diào)控元件序列后，構(gòu)建BAC克隆載體，并將此BAC載體進(jìn)行受精卵原核注射法，構(gòu)建BAC轉(zhuǎn)基因Cre小鼠模型。雖然該轉(zhuǎn)基因技術(shù)也是隨機(jī)整合插入，但其具有降低了質(zhì)粒DNA隨機(jī)插入引起的位置效應(yīng)影響，避免了Cre基因5’ 端敲入可能引起的雜合缺失有表型等方面的優(yōu)勢(shì)。另外，相對(duì)于短啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)基因而言，BAC載體包含了更多的基因表達(dá)相關(guān)的調(diào)控元件序列，因而更能反映內(nèi)源基因的表達(dá)特征。但是，BAC轉(zhuǎn)基因的首建鼠，仍會(huì)出現(xiàn)因BAC克隆載體插入位點(diǎn)的不同，而引起Cre表達(dá)活性不同的現(xiàn)象。因此，該方法并不能解決傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的所有不足，比如，插入位點(diǎn)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的局部影響作用，以及潛在基因插入突變，造成Cre非真實(shí)表達(dá)等風(fēng)險(xiǎn)。而且，在BAC轉(zhuǎn)基因Cre小鼠構(gòu)建的同時(shí)，也可能增加了附帶相應(yīng)基因的拷貝數(shù)，從而干擾了相關(guān)基因功能研究的客觀分析。盡管如此，相對(duì)于傳統(tǒng)較小啟動(dòng)子的Cre表達(dá)載體而言，BAC轉(zhuǎn)基因技術(shù)還是具有其明顯的優(yōu)勢(shì)。

4. 安全位點(diǎn)敲入Cre小鼠模型：目前最新的Cre小鼠模型構(gòu)建策略。為了避免基因隨機(jī)插入可能導(dǎo)致諸多不利因素影響（比如表達(dá)位置影響作用及插入突變等），通過(guò)將Cre定點(diǎn)敲入到所謂的“安全” 位點(diǎn)，比如 Rosa26、Hprt 和 Hipp 11等位點(diǎn)。其中以Rosa26位點(diǎn)最為常用。

Rosa26位點(diǎn)特點(diǎn)，其本身含有基因轉(zhuǎn)錄的廣泛?jiǎn)��?dòng)子，形成mRNA，卻無(wú)翻譯蛋白。所以，該基因無(wú)特定功能。借用該基因位點(diǎn)本身的特點(diǎn)與優(yōu)勢(shì)，有助于構(gòu)建全身表達(dá)Cre基因單拷貝定點(diǎn)敲入小鼠模型。而Hprt和Hipp11位點(diǎn)則比較適合構(gòu)建組織特異性敲入Cre小鼠模型。

四、為什么要構(gòu)建誘導(dǎo)性調(diào)控CreERT小鼠模型及其基本特征
前面介紹的Cre小鼠模型，其作用特異性及特征，是由引導(dǎo)Cre表達(dá)的基因啟動(dòng)子特征或構(gòu)建策略方法決定的。由于許多所謂特異性基因的表達(dá)，貫穿了整個(gè)細(xì)胞/組織的胚胎發(fā)育成熟過(guò)程。而由這類(lèi)基因特性啟動(dòng)子構(gòu)建的所謂細(xì)胞/組織特異性Cre小鼠，其Cre活性作用，可能始于小鼠的胚胎時(shí)期。如果研究的靶基因又是小鼠生長(zhǎng)發(fā)育非常重要的基因，過(guò)早實(shí)施Cre-loxP重組系統(tǒng)作用，有可能導(dǎo)致胚胎發(fā)育期靶基因的敲除，產(chǎn)生生殖系基因敲除小鼠的結(jié)果，也就難以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞組織的特異性敲除靶基因的目的。所以，如何控制Cre表達(dá)的時(shí)間，使其成為可被誘導(dǎo)調(diào)控，即通過(guò)使用誘導(dǎo)物的方式，可以掌控Cre表達(dá)時(shí)間，結(jié)合細(xì)胞/組織特異性Cre特征，達(dá)到時(shí)空條件性靶基因敲除/表達(dá)的研究目的。

所謂可誘導(dǎo)性調(diào)控CreERT系統(tǒng)，是將Cre基因與雌激素受體（ER）配體結(jié)合域突變體（ERT）融合一起構(gòu)建而成。該ERT只與合成的ER配體結(jié)合，比如4-羥基他莫昔芬（為藥物Tamoxifen的活性代謝物）。 在無(wú)該誘導(dǎo)劑存在下，CreERT融合蛋白與細(xì)胞漿中HSP90結(jié)合，以非活性狀態(tài)存在于細(xì)胞漿，無(wú)法發(fā)揮Cre-loxP重組系統(tǒng)作用。當(dāng)對(duì)CreERT/floxed小鼠體內(nèi)提供藥物誘導(dǎo)劑Tamoxifen (TAM），Cre蛋白與HSP90蛋白分離，進(jìn)入細(xì)胞核，識(shí)別靶基因中的loxP位點(diǎn)，發(fā)揮Cre-loxP位點(diǎn)細(xì)胞/組織特異性及時(shí)間特定的重組切割作用。

CreERT小鼠為雌激素受體配體結(jié)合域中只有一個(gè)突變位點(diǎn)（G521R），目前常用的CreERT2小鼠，則是在相應(yīng)配體結(jié)合域中引入3個(gè)突變位點(diǎn)（C400V/M453A/L544A), 大大提高了其對(duì)誘導(dǎo)物TAM的敏感性與特異性。

在特定時(shí)間和部位發(fā)揮誘導(dǎo)Cre-loxP重組切割作用能力，無(wú)疑極大提高了實(shí)驗(yàn)研究的靈活性。同時(shí)也增加了研究者實(shí)際應(yīng)用該誘導(dǎo)性Cre-loxP特異性重組系統(tǒng)的挑戰(zhàn)性，比如，對(duì)于該系統(tǒng)可能出現(xiàn)的包括Cre泄露表達(dá)作用，以及可能的毒性作用等，都需要研究者在實(shí)際應(yīng)用中倍加謹(jǐn)慎小心。

五、Cre轉(zhuǎn)基因小鼠模型中Cre插入位點(diǎn)鑒定的挑戰(zhàn)與重要性

目前常用的Cre小鼠模型中，采用傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因策略構(gòu)建的小鼠模型仍是占比最大。然而，對(duì)于轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，基因隨機(jī)插入位點(diǎn)的相關(guān)鑒定研究占比非常少。有分析數(shù)據(jù)表明，只有不到5.2% ( 416/8012 ) 轉(zhuǎn)基因小鼠模型，研究報(bào)道了基因隨機(jī)插入的位點(diǎn)，而其中只有約2.3%（36/1631）轉(zhuǎn)基因Cre小鼠品系，明確分析了其插入位點(diǎn)，提示分析鑒定轉(zhuǎn)基因隨機(jī)插入位點(diǎn)所面臨的挑戰(zhàn)性。

為什么需要鑒定分析轉(zhuǎn)基因隨機(jī)插入位點(diǎn)？第一，有利于轉(zhuǎn)基因小鼠特定基因型引物的設(shè)計(jì)，便于純合Cre小鼠的鑒定；第二，有助于條件性靶基因?qū)嶒?yàn)研究中，相關(guān)基因型鑒定分析策略及特異性PCR引物設(shè)計(jì)；第三，了解可能潛在的插入突變引起的非期望表型，比如隨機(jī)插入導(dǎo)致的直接或間接的內(nèi)源基因編碼序列，或附近相關(guān)調(diào)控序列的破壞改變，以及引起反轉(zhuǎn)/復(fù)制等的復(fù)合結(jié)構(gòu)改變等。

應(yīng)用靶向位點(diǎn)擴(kuò)增（Targeted locus amplification -TLA）技術(shù)，能有效分析鑒定隨機(jī)轉(zhuǎn)基因插入位點(diǎn)與插入基因性質(zhì)特征。 有研究者應(yīng)用該技術(shù)，對(duì)選擇的40多種常用的轉(zhuǎn)基因Cre小鼠模型，進(jìn)行分析研究發(fā)現(xiàn)，有30種Cre小鼠模型，由于基因的隨機(jī)插入，導(dǎo)致了相應(yīng)基因組結(jié)構(gòu)性變化，其中包括24種小鼠出現(xiàn)基因結(jié)構(gòu)的缺失，6種出現(xiàn)結(jié)構(gòu)重復(fù)。 50 % 轉(zhuǎn)基因Cre小鼠內(nèi)源性基因受損，且多表現(xiàn)為DNA大片段缺失和/或插入位點(diǎn)相關(guān)基因結(jié)構(gòu)改變。由于隨機(jī)插入導(dǎo)致的基因結(jié)構(gòu)改變，可誘發(fā)非期望的相關(guān)表型，從而影響到Cre-loxP重組特異性靶基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

六、Cre-loxP位點(diǎn)重組系統(tǒng)應(yīng)用中常見(jiàn)風(fēng)險(xiǎn)及影響因素
Cre小鼠模型作用的一致性與可重復(fù)性，是分析解釋實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠性的保證。然而，回顧過(guò)去研制的一些Cre小鼠模型，觀察分析其實(shí)際應(yīng)用中的情況發(fā)現(xiàn)，不少所謂特異性Cre小鼠模型，其Cre的靶基因切割活性，明顯存在不均勻和/或不一致的現(xiàn)象。比如，MMTV-Cre、Krt19-Cre、Gata4-Cre和Nes-Cre/ERT2小鼠等, 都報(bào)道有不同程度泄露表達(dá)等非特異性作用效果。

某些Cre小鼠模型，常出現(xiàn)Cre非特異性/非預(yù)期/異位等異常表達(dá)現(xiàn)象， 從而影響表型結(jié)果分析及解釋的準(zhǔn)確性。比如，Myh6-Cre、Ins2-Cre、Vil-Cre、Ddx4-Cre和Pdx1-Cre等。也有些Cre小鼠模型表現(xiàn)有生殖系細(xì)胞作用活性，從而引起Cre-loxP重組系統(tǒng)的廣泛而非特異性的切割作用。

關(guān)于Cre小鼠的所謂非特異脫靶重組作用的原因，目前多認(rèn)為，與如下因素有關(guān)，第一，應(yīng)用不同的Cre小鼠構(gòu)建策略與技術(shù)；第二，Cre小鼠起初研制的時(shí)候，研制者很明確其實(shí)際應(yīng)用的特殊目的，從而導(dǎo)致對(duì)Cre小鼠特征鑒定的關(guān)注點(diǎn)存在偏差，忽略了對(duì)其進(jìn)行全面完整而系統(tǒng)的相關(guān)分析。然而，當(dāng)這些Cre小鼠模型成為公共應(yīng)用資源后，由于研究者們的廣范圍應(yīng)用，也使人們有更多機(jī)會(huì)對(duì)其期望作用的靶組織，以及作用范圍區(qū)域和多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞/組織類(lèi)型等重組切割活性，進(jìn)行更加精確及深入的實(shí)驗(yàn)研究。

Cre小鼠令人困惑的潛在非特異性作用的脫靶活性風(fēng)險(xiǎn)，以及引起可能的毒性作用，不僅可導(dǎo)致靶基因敲除小鼠的死亡，或非靶基因敲除引起的非特異性表型。由于這類(lèi)Cre小鼠引起的脫靶活性作用，其實(shí)已代表了Cre的真正活性作用，自然也限制了這類(lèi)小鼠模型，未來(lái)進(jìn)一步應(yīng)用的價(jià)值。

1. Cre非特異性/錯(cuò)誤重組作用/隨機(jī)插入突變的影響因素
目前常用的Cre小鼠模型多為傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建，即采用所謂細(xì)胞/組織特異性的啟動(dòng)子部分DNA片段策略，加上基因隨機(jī)插入，可能產(chǎn)生所謂的基因表達(dá)位置效應(yīng)等特征，造成Cre表達(dá)的不準(zhǔn)確或泄漏，難以真實(shí)反映真正期望的特異性，導(dǎo)致Cre表達(dá)出現(xiàn)脫靶切割作用。

有研究通過(guò)分析常用的幾種胸腺特異性Cre轉(zhuǎn)基因小鼠模型（比如Lck-Cre, CD2-Cre和CD4-Cre）的非特異性作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，雖然這些小鼠均是應(yīng)用胸腺特異性啟動(dòng)子構(gòu)建的，但Cre表達(dá)，可導(dǎo)致小鼠胸腺細(xì)胞量中等或嚴(yán)重程度的減少，且表現(xiàn)有劑量和拷貝數(shù)量依賴(lài)的特征。

由于Cre重組酶非特異性識(shí)別并作用于基因組中與loxP位點(diǎn)相似的序列，也稱(chēng)隱秘loxP（cloxP) 位點(diǎn)，引起Cre-cloxP位點(diǎn)的非特異性重組切割作用，從而有可能導(dǎo)致重要或關(guān)鍵基因破壞，輕則引起非特異性細(xì)胞表型，重則研究組織器官破壞或小鼠死亡。

對(duì)Tek-Cre小鼠模型進(jìn)行基因插入位點(diǎn)分析研究表明，由于Cre的隨機(jī)插入，導(dǎo)致241-kb大小DNA缺失, 影響到相關(guān)蛋白編碼基因（比如Mtrr、Fastkd3和Adcy2等）表達(dá)， 且小鼠出現(xiàn)發(fā)育異常的表型，而該表型可能與Mtrr基因的缺失有關(guān)，因?yàn)镸trr基因敲除小鼠，即可導(dǎo)致后代小鼠發(fā)育嚴(yán)重障礙。

另外，在分析某些Cre轉(zhuǎn)基因（比如Ins2-Cre、Nes-Cre、Alb-Cre和Lck-Cre）小鼠模型也發(fā)現(xiàn)，某些非預(yù)期DNA成分出現(xiàn)，比如，人生長(zhǎng)激素 (hGH) 微小基因片段。并觀察到Nes-Cre和Ins2-Cre兩種小鼠品系都出現(xiàn)代謝方面的明顯表型，且Ins2-Cre小鼠出現(xiàn)不明原因的，與年齡相關(guān)的糖耐受異常。但Alb-Cre和Lck-Cre兩種小鼠品系，卻未見(jiàn)相似表型。表明hGH微小基因在不同轉(zhuǎn)基因小鼠中，可表現(xiàn)不同的表達(dá)及影響作用。

也有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，在分析的40種轉(zhuǎn)基因Cre小鼠模型中，有10種Cre小鼠伴隨有E.coli DNA序列的污染，DNA片段大小由～300 bp到超過(guò)200 kb。且證實(shí)，小DNA片段與克隆載體如pBACe3.6相同。出現(xiàn)細(xì)菌和載體DNA相互污染的推測(cè)原因，可能與注射載體DNA制備過(guò)程有關(guān)。但關(guān)于此類(lèi)污染的影響作用，目前還不太明確。但有研究報(bào)道，細(xì)菌DNA序列可沉默及影響轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。

一般認(rèn)為，隨機(jī)插入轉(zhuǎn)基因構(gòu)建Cre小鼠模型的策略與技術(shù)，存在許多不確定的風(fēng)險(xiǎn)。比如，Cre隨機(jī)插入，干擾附近內(nèi)源基因表達(dá)水平，從而導(dǎo)致Cre作用的所謂脫靶表達(dá)現(xiàn)象。

即使應(yīng)用定點(diǎn)敲入策略構(gòu)建Cre小鼠模型，也可能造成相應(yīng)基因表達(dá)影響，導(dǎo)致該小鼠模型出現(xiàn)一定的病理改變表型。特別是采用將Cre敲入內(nèi)源基因的5’端構(gòu)建策略。比如，Foxg1-Cre敲入/敲除小鼠，就是在Cre敲入內(nèi)源性Foxg1基因位點(diǎn)同時(shí)，也敲除了該基因，而 Foxg1基因參與小鼠大腦半球發(fā)育過(guò)程，所以，該Cre純合子小鼠在圍產(chǎn)期死亡。 雖然，Foxg1- Cre雜合小鼠，仍可發(fā)揮腦部組織特異性靶向作用，實(shí)現(xiàn)小鼠大腦半球、視前/視囊泡、嗅覺(jué)上皮神經(jīng)和咽囊部等部位靶基因特異性敲除的目的。

2. Cre重組酶高表達(dá)的毒性作用
Cre重組酶在細(xì)胞內(nèi)的大量蓄積，可直接引起DNA破壞及細(xì)胞死亡。研究已表明，對(duì)于高表達(dá)Cre的轉(zhuǎn)基因小鼠，表現(xiàn)為其存活及繁殖能力降低。CAG-Cre和CD2-Cre小鼠模型就是典型例子。

Myh6-Cre小鼠是心肌特異性常用小鼠模型, 借助aMyHC啟動(dòng)子及隨機(jī)插入轉(zhuǎn)基因的策略構(gòu)建而成。對(duì)比小鼠Cre不同表達(dá)水平的影響作用發(fā)現(xiàn)，Cre高表達(dá)小鼠發(fā)生非特異性重組作用，從而影響到小鼠心肌的正常功能。而Cre低表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠，則無(wú)非特異性重組作用。研究者認(rèn)為，高表達(dá)的Cre與小鼠體內(nèi)某些所謂隱秘loxP(cloxP)位點(diǎn)，發(fā)生非特異性的重組切割效應(yīng)，達(dá)到破壞相關(guān)基因功能的作用。

神經(jīng)元細(xì)胞中高表達(dá)的Cre可引起小鼠腦發(fā)育受損。研究分析Nestin-Cre和兩個(gè)Nestin-CreERT2轉(zhuǎn)基因小鼠品系證實(shí)， 所有純合Nestin-Cre 小鼠，都有胚胎發(fā)育延遲及神經(jīng)元增殖降低、異倍體增加與細(xì)胞凋亡病理現(xiàn)象、最終導(dǎo)致小鼠小腦癥和腦積水等發(fā)育缺陷表型。

高水平Cre表達(dá)也可直接影響視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞功能。比較分析不同視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞 (RPE) 特異性Cre轉(zhuǎn)基因小鼠后發(fā)現(xiàn)，常用Trp1-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠本身，就伴隨RPE單層細(xì)胞結(jié)構(gòu)混亂、RPE區(qū)域萎縮、視網(wǎng)膜感光細(xì)胞功能喪失、以及小膠質(zhì)細(xì)胞激活等病理變化。

作為代謝性疾病常用的RIP (Ins2)-Cre小鼠，也見(jiàn)有糖耐受反應(yīng)或誘發(fā)糖尿病發(fā)生，并推測(cè)可能與胰島素分泌受損有關(guān)。

有報(bào)道表明，誘導(dǎo)性腸特異性Villin-CreERT2小鼠，經(jīng)TAM激活后，可借助隱秘loxP位點(diǎn)，引起非特異性DNA破壞作用。

3. Cre生殖系重組作用與小鼠性別影響
通過(guò)對(duì)64種不同神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)Cre小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，有64.1%小鼠有生殖系重組作用，且29種(占82.8%) 有性別差異，其中父本Cre小鼠有完全或選擇性生殖性重組活性作用占62.1%，而母本Cre小鼠則只占20.1%。只有17.2%的Cre小鼠，具有相似的生殖系重組作用。 比如，Foxg1-Cre/floxed 雙基因編輯雄性小鼠與野生雌性小鼠交配的后代，會(huì)出現(xiàn)有一定程度生殖細(xì)胞基因敲除現(xiàn)象（68.8%），但未見(jiàn)Foxg1-Cre雌性小鼠的生殖細(xì)胞作用。

分析這些Cre小鼠出現(xiàn)生殖系重組作用的可能原因及其影響因素，包括小鼠模型構(gòu)建策略技術(shù)本身，比如，轉(zhuǎn)基因還是定點(diǎn)敲入策略、啟動(dòng)子的選擇、Cre插入位點(diǎn)及表達(dá)水平、5’ 端還是3’端敲入、IRES與2A連接方式等都可為潛在影響因素。比如，所謂內(nèi)皮細(xì)胞特異性Tek-Cre (Tie2-Cre)轉(zhuǎn)基因小鼠模型，多是借助Tek基因的2.1 kb啟動(dòng)子加10 kb內(nèi)含子片段區(qū)域構(gòu)建而成。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該Cre表達(dá)活性出現(xiàn)于小鼠胚胎7.5天，且表現(xiàn)一定程度造血干細(xì)胞系的重組活性。且母本小鼠顯示有明顯的生殖系重組作用。現(xiàn)已證實(shí)，因Tek基因調(diào)控序列在胚胎發(fā)育過(guò)程及生殖系細(xì)胞具有活性作用，從而引起了靶基因在生殖系被敲除的結(jié)果。

4. Cre作用的鑲嵌現(xiàn)象 (Mosaicism)  
由于變化或不一致的Cre表達(dá)作用，導(dǎo)致同一小鼠體內(nèi)不同細(xì)胞或組織中，Cre重組切割作用活性及效率表現(xiàn)差異，因而引起靶基因在不同細(xì)胞或組織被敲除的效果，呈現(xiàn)不一致的現(xiàn)象。比如，Vav1-Cre或Fabp4-Cre小鼠品系，其Cre小鼠作用的子代同窩小鼠中，因Cre作用引起的遺傳改變相關(guān)表型，也存在差異的可能性。另外，EIIa-Cre小鼠作為常用的廣泛細(xì)胞組織靶基因完全敲除的工具，實(shí)際應(yīng)用中也被證實(shí)，雄性Ella-Cre小鼠明顯有鑲嵌表達(dá)的特性，而雌性Ella-Cre小鼠的重組切割活性, 則更加均勻一致。因而建議用雌性Ella-Cre小鼠與條件性靶向(floxed) 雄性小鼠進(jìn)行交配，以獲得更為理想而完整的重組切割效果。

5. 小鼠遺傳背景影響作用
研究已發(fā)現(xiàn)，不同遺傳背景的同一Cre小鼠模型，其重組切割活性作用也可不同。比如，眼睛特異性Le-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠所引起的眼睛異常表型，就與其遺傳背景的影響有關(guān)。當(dāng)該Cre小鼠常用FVB/N品系與CBA/Ca遺傳背景小鼠交配7代后，部分CBA/Ca品系的Le-Cre小鼠，出現(xiàn)明顯眼睛異常表型。且CBA/Ca品系小鼠眼睛表型的嚴(yán)重性及出現(xiàn)頻率，也可通過(guò)回交FVB小鼠2代而逆轉(zhuǎn)消除。

6. TAM應(yīng)用中相關(guān)問(wèn)題
CreERT2-loxP位點(diǎn)特異性誘導(dǎo)性重組系統(tǒng)，需要誘導(dǎo)劑TAM參與完成。然而，實(shí)際應(yīng)用中，有許多因素可影響其作用效果，并可能引起非特異性及相關(guān)毒副作用，則應(yīng)加以了解關(guān)注與重視。

（1）關(guān)于TAM有效誘導(dǎo)的最優(yōu)劑量與途徑
通過(guò)對(duì)已報(bào)道的CreERT小鼠品系應(yīng)用研究分析中，尋找最佳TAM誘導(dǎo)有效性是比較困難的，部分原因是因?yàn)?/span>不同研究，應(yīng)用了不同的實(shí)驗(yàn)方案策略與操作流程，包括多種不同的TAM制備及使用劑量，各種給藥途徑等。比如，Columbia大學(xué)對(duì)相關(guān)研究者們的問(wèn)卷調(diào)查表明，TAM制備方法（玉米油配制為多，其次為向日葵油和花生油等）、使用劑量（20mg～175 mg等）、給藥途徑及次數(shù)（腹腔注射最多，包括有單次、2-4次和5次等，其次為口服灌胃等）、以及誘導(dǎo)效果檢測(cè)方法（RT-PCR和免疫熒光染色為主）等均有明顯不同。

雖然，目前大部分研究都是采用TAM腹腔注射（IP）給藥的方式，但也有研究比較了IP給藥與口服灌胃（PO）給藥方式效果，發(fā)現(xiàn)PO方式在降低TAM毒性方面，可能更有優(yōu)勢(shì)。且發(fā)現(xiàn)老年CreERT小鼠，往往需要更高劑量與更長(zhǎng)時(shí)間TAM誘導(dǎo)，以獲得滿意的CreERT作用活性。

關(guān)于最佳TAM有效誘導(dǎo)劑量與給藥途徑，目前的相關(guān)知識(shí)仍很有限，需要繼續(xù)探索與積累。也建議研究者根據(jù)實(shí)際具體情況，篩選出適合研究計(jì)劃的最佳劑量與途徑。

（2）TAM誘導(dǎo)毒性
目前已經(jīng)明確，高劑量腹腔給藥TAM，有長(zhǎng)期毒性作用，可增加小鼠發(fā)病及死亡率。比如，廣泛誘導(dǎo)性R26CreERT2小鼠，如果使用高濃度TAM（175 mg/kg, 口腔連續(xù)5天）誘導(dǎo)，小鼠出現(xiàn)胸腺萎縮、嚴(yán)重貧血、以及造血細(xì)胞異常染色體重排等造血系統(tǒng)相關(guān)毒性反應(yīng)。

也有研究發(fā)現(xiàn)，心肌特異性誘導(dǎo)表達(dá)的MerCreMer (MCM) 轉(zhuǎn)基因小鼠，經(jīng)中高劑量TAM（60～90 ug/g, 腹腔連續(xù)3～5天）處理后，~60-80%的MCM小鼠出現(xiàn)心臟纖維化，且伴有促炎癥細(xì)胞因子表達(dá)的增加,  最終導(dǎo)致心臟功能衰竭及小鼠死亡。但減少TAM誘導(dǎo)使用劑量或次數(shù)（比如30 ug/g，腹腔連續(xù)3天給藥），不僅可以實(shí)現(xiàn)Cre特異性重組作用的最大化（～84%），且最低程度降低其心臟毒性作用的效果。同時(shí)，建議應(yīng)用TAM處理的MCM小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照。

進(jìn)一步分析MCM小鼠CreERT轉(zhuǎn)基因插入位點(diǎn)證實(shí)，該MCM轉(zhuǎn)基因插入到小鼠基因組染色體19的C1區(qū)域，導(dǎo)致約~20 kb基因組片斷缺失，該片斷包含A1cf基因外顯子1及部分內(nèi)含子1區(qū)域。

關(guān)于TAM誘導(dǎo)MCM小鼠心臟毒性的可能原因，相關(guān)研究認(rèn)為，TAM誘導(dǎo)的心臟纖維化及心臟衰竭，不是由于MCM的隨機(jī)插入位點(diǎn)及TAM使用劑量本身的高低引起的，而是因?yàn)橹懈邉┝?/span>TAM誘導(dǎo)作用，使Cre表達(dá)相應(yīng)增加，從而引起可能的Cre與cloxP隱秘位點(diǎn)的非特異性重組切割有關(guān)。因?yàn)椋��?/span>1）不同年齡的MCM小鼠本身未見(jiàn)心臟纖維化現(xiàn)象；（2）同樣高劑量TAM誘導(dǎo)野生B6小鼠，未見(jiàn)小鼠心臟纖維化改變；（3）高劑量TAM可引起MCM小鼠體內(nèi)心肌細(xì)胞程序性死亡增加，且可能與DNA破壞激活及p53基因穩(wěn)定性下降有關(guān)；（4）體外原代細(xì)胞證實(shí)，高表達(dá)Cre重組酶，能直接引起細(xì)胞的程序性死亡。

有研究對(duì)不同策略構(gòu)建（隨機(jī)插入和定點(diǎn)敲入）的兩種誘導(dǎo)性CD4-CreERT2小鼠品系比較分析，通過(guò)將其分別與純合Rosa26-loxP-stop-loxP-YFP報(bào)告小鼠進(jìn)行交配，TAM誘導(dǎo)后，觀察體內(nèi)T濾泡輔助細(xì)胞（Tfh) 動(dòng)態(tài)適合反應(yīng)，并用不完全蛋白偶聯(lián)的NP-KLH抗原免疫小鼠，以誘發(fā)輔助性Tfh細(xì)胞的分化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)CD4-CreERT2隨機(jī)插入轉(zhuǎn)基因小鼠，可降低了輔助性Tfh細(xì)胞分化數(shù)量，干擾了細(xì)胞的存活。而低表達(dá)CreERT2的定點(diǎn)敲入小鼠， 則能避免因Cre表達(dá)過(guò)高造成的細(xì)胞損失作用，且仍能有效發(fā)揮其淋巴細(xì)胞特異性重組效率。

前面介紹的TAM誘導(dǎo)的毒性作用研究報(bào)道，多與高劑量TAM使用及高表達(dá)Cre作用相關(guān)。但最近有研究表明，低劑量TAM（20 mg/kg）誘導(dǎo)也會(huì)影響小鼠骨形成。研究者采用不同劑量TAM（0、20、40和200 mg/kg，腹腔連續(xù)4天）誘導(dǎo)4周齡野生B6小鼠，結(jié)果表明，20 mg/kg劑量TAM誘導(dǎo)，即可引起小鼠股骨體積比（骨體積/總體積）增加153%。因此提示，即使應(yīng)用非常低劑量的TAM誘導(dǎo)，在實(shí)際CreERT骨特異性靶基因敲除/表達(dá)的研究中，也需要考慮TAM誘導(dǎo)可能影響到小鼠骨小梁和皮質(zhì)骨的形成過(guò)程。

七、Cre-loxP位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)應(yīng)用中的思考與建議

• Cre小鼠模型構(gòu)建策略與方法不同，直接會(huì)影響到Cre-loxP重組系統(tǒng)作用的特異性及其潛在風(fēng)險(xiǎn)。

 從起初傳統(tǒng)隨機(jī)插入研制技術(shù)構(gòu)建的Cre小鼠品系，發(fā)現(xiàn)該技術(shù)方法自身存在許多不利因素開(kāi)始，研究者們一直在不斷探索研制更加合理的構(gòu)建策略與方法。

采用BAC介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)目的，是為了提升Cre表達(dá)的準(zhǔn)確特異性。因?yàn)?/span>BAC克隆更可能包含內(nèi)源基因的所有調(diào)控元件相關(guān)序列。但是，某些基因表達(dá)調(diào)控的遠(yuǎn)端順式調(diào)控元件或反式調(diào)控元件，有可能并不存在或包含于所選擇的BAC克隆載體中，從而導(dǎo)致Cre表達(dá)無(wú)法真正反映內(nèi)源細(xì)胞類(lèi)型或組織特異性。

最終，采取將Cre基因直接敲入到內(nèi)源基因位點(diǎn)的策略，成為目前研制Cre小鼠模型的首選。一般認(rèn)為，為了更加準(zhǔn)確復(fù)制內(nèi)源基因的表達(dá)特征，可選擇通過(guò)取代內(nèi)源基因編碼序列的方式（比如CD19-Cre）； 然而，該定點(diǎn)敲入/敲除策略，有可能會(huì)影響/破壞內(nèi)源基因表達(dá)。如果該基因?yàn)殡s合缺失有表型，獲得的雜合敲入Cre小鼠，可能會(huì)顯示一定的表型。即使是雜合缺失無(wú)表型基因，單等位基因的破壞，在實(shí)際應(yīng)用中，也建議避免使用純合Cre小鼠。比如，CD19-Cre敲入/敲除小鼠模型，作為B細(xì)胞特異性Cre小鼠，雖然純合小鼠無(wú)任何可見(jiàn)的表型，但由于Cre基因的敲入，使該小鼠缺乏B細(xì)胞B-1亞型，表現(xiàn)為血清IgM減少，對(duì)T細(xì)胞依賴(lài)抗原反應(yīng)能力嚴(yán)重受損，無(wú)法形成供B細(xì)胞增殖與生長(zhǎng)的脾臟生發(fā)中心。因此，如果應(yīng)用純合CD19-Cre小鼠，開(kāi)展相關(guān)靶基因B細(xì)胞特異性敲除研究，自然很難以獲得正確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

如果為了避免Cre定點(diǎn)敲入基因5‘端，可能引起的不良反應(yīng)，建議選擇將其敲入到內(nèi)源基因編碼區(qū)域外的3' 端非翻譯區(qū)域（UTR）的方式 。然而，該定點(diǎn)敲入的構(gòu)建策略，也存在一定的限制。由于多數(shù)基因轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控過(guò)程多發(fā)生在其3’UTR區(qū)域，因此，在該區(qū)域的內(nèi)源基因mRNA末端，添加相關(guān)附加基因序列的改變，存在潛在影響內(nèi)源基因表達(dá)水平及其特征的可能性。

所以，由于不同構(gòu)建策略方法存在的局限性，有可能產(chǎn)生Cre潛在毒性或干擾相應(yīng)內(nèi)源靶基因的表達(dá)，導(dǎo)致Cre-loxP重組系統(tǒng)的非特異性生物學(xué)效應(yīng)。為了避免實(shí)驗(yàn)研究中，出現(xiàn)對(duì)研究結(jié)果的錯(cuò)誤解釋?zhuān)?/span>考慮用Cre小鼠，作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照是有必要的。

2. Cre表達(dá)特異性及效率等特征可能與其實(shí)際介導(dǎo)的重組切割活性不一致。
報(bào)告小鼠已成為驗(yàn)證確定Cre活性與組織特異性等特征的非常有用工具。該種報(bào)告小鼠在其報(bào)告基因（如lacZ 或熒光蛋白）前插入兩端都攜帶有loxP位點(diǎn)的終止序列，且這些報(bào)告系統(tǒng)多構(gòu)建在特定所謂“安全”位點(diǎn)（比如最為常用的Rosa26位點(diǎn)）。

有研究發(fā)現(xiàn)，科學(xué)家們可以通過(guò)報(bào)告小鼠的驗(yàn)證，獲得非常完美的所謂Cre小鼠品系，而在實(shí)際應(yīng)用中卻發(fā)現(xiàn)，Cre-loxP重組系統(tǒng)的特異性靶基因作用，卻遠(yuǎn)不能滿足研究期望目標(biāo)，表現(xiàn)為該Cre小鼠特異性靶基因切割活性非常不理想或是過(guò)分夸張�？赡艿脑�因解釋之一，與Rosa26位點(diǎn)本身相對(duì)松散的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)特性，從而增加了其與Cre蛋白結(jié)合敏感性等有關(guān)。另外，也有研究表明，某些R26R報(bào)告小鼠本身，會(huì)出現(xiàn)不依賴(lài)Cre重組作用的熒光泄露表達(dá)現(xiàn)象，比如，R26R-LSL-Green和R26R-LSL-tdTomato報(bào)告小鼠。

其實(shí)Cre重組切割活性效率差異，不僅表現(xiàn)在Rosa26位點(diǎn)與實(shí)際靶基因位點(diǎn)之間，也表現(xiàn)在不同靶基因之間。提示，由Cre-loxP重組系統(tǒng)介導(dǎo)的切割作用的所謂“敏感性”或效率方面，在每個(gè)不同的靶基因作用位點(diǎn)上，都可能表現(xiàn)其獨(dú)特性質(zhì)與特征。比如，某Cre小鼠品系可能對(duì)某個(gè)靶基因位點(diǎn)的切割效率只有10%，但卻可對(duì)另外靶基因位點(diǎn)，達(dá)短100% 重組切割作用。

所以，實(shí)際應(yīng)用中需要注意的是，雖然報(bào)告小鼠能提供Cre表達(dá)作用的某些特征，但該小鼠對(duì)實(shí)際靶基因的特異性重組切割作用效果，必須根據(jù)其對(duì)某個(gè)特定基因的單個(gè)細(xì)胞水平上的實(shí)際作用效果進(jìn)行評(píng)估。

3. 需要在特定的靶細(xì)胞/組織中鑒定Cre作用活性，以確保其作用的靶向特異性。
為了避免或降低某些Cre小鼠可能引起的明顯非特異性脫靶作用，在應(yīng)用Cre-loxP重組系統(tǒng)，進(jìn)行靶基因編輯的實(shí)驗(yàn)研究中，需要設(shè)計(jì)合理的PCR鑒定引物組合，目的在于分析鑒別靶基因重組打靶的不同情況，比如，基因的雜合敲除、純合敲除、未敲除，以及野生對(duì)照等可能的多種情況。

一般情況下，應(yīng)用小鼠尾巴DNA鑒定策略，進(jìn)行所謂常規(guī)特異性基因型鑒定的時(shí)候，都不應(yīng)該檢測(cè)到靶基因被敲除的結(jié)果，除非該研究就是要特異性敲除皮膚上皮細(xì)胞的靶基因。這也是判斷Cre小鼠是否具有生殖細(xì)胞敲除作用的關(guān)鍵。借助如此簡(jiǎn)單鑒定方法，能非�？焖俸Y選出那些無(wú)非特異性切割作用的Cre小鼠品系，以確保實(shí)驗(yàn)研究的有效性與可靠性。而且，也可將靶細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞群，進(jìn)行有效分離和檢測(cè)，以明確特異性基因敲除的效率。

判斷Cre小鼠是否具有生殖系作用活性的另外一個(gè)簡(jiǎn)單方法，是將雙性別的Cre小鼠分別與相應(yīng)性別的報(bào)告基因小鼠交配，獲得的陽(yáng)性后代小鼠（F1），再與野生小鼠交配，分析其后代小鼠（F2）的報(bào)告基因表達(dá)情況，如果此F2小鼠報(bào)告基因的表達(dá)較其F1更加明顯廣泛，提示該Cre小鼠可能具有生殖系作用活性。

在Cre-loxP重組系統(tǒng)實(shí)際應(yīng)用中，如果是以提高Cre重組切割作用效率為目的，可采用先建立將靶基因單等位基因，在生殖細(xì)胞中敲除小鼠，再與floxed條件性打靶小鼠繁殖的策略。但必須清楚該策略的局限性，即不適合那些靶基因雜合敲除有表型的情況。另外，也不適合需要敲除兩個(gè)基因以上的實(shí)驗(yàn)研究。

• Cre-loxP重組系統(tǒng)與其他重組系統(tǒng)聯(lián)合應(yīng)用，增加細(xì)胞譜系示蹤研究的特異性及有效性

細(xì)胞譜系示蹤的研究是借助Cre在特定靶細(xì)胞的激活，并通過(guò)相應(yīng)報(bào)告基因的表達(dá)來(lái)顯示。最為常見(jiàn)的報(bào)告基因為熒光蛋白，其表達(dá)的特異性與時(shí)空性完全依賴(lài)于特定Cre激活重組特性。因此，Cre/CreERT2小鼠與報(bào)告基因小鼠結(jié)合，常應(yīng)用于細(xì)胞譜系示蹤、行為學(xué)和鑲嵌組織中敲除細(xì)胞分布等方面研究。

為了改善細(xì)胞譜系示蹤準(zhǔn)確性及有效性，重要的是如何準(zhǔn)確有效標(biāo)記示蹤特定細(xì)胞群及其后代中某類(lèi)特殊細(xì)胞。如果報(bào)告基因在其他細(xì)胞群，發(fā)生非特異性表達(dá)，或者即使是正確的靶細(xì)胞群標(biāo)記表達(dá)，但并非出現(xiàn)于研究所期望時(shí)間窗口期，都可能導(dǎo)致錯(cuò)誤的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果。

所謂Cre-loxP和Dre-rox雙重組系統(tǒng) , 即利用Cre和Dre雙重組酶識(shí)別各自特定loxP 和rox位點(diǎn)，比如，分別構(gòu)建靶基因（比如基因X和Y）相關(guān)的雙重組酶小鼠，即X-Dre和Y-CrexERT2兩種小鼠模型。而Y-CrexERT2小鼠的構(gòu)建，則是通過(guò)在CreERT2載體中ERT2序列兩端分別添加一個(gè)rox位點(diǎn)序列，從而構(gòu)建基因X和Y特異性啟動(dòng)子介導(dǎo)的兩種Cre小鼠品系。應(yīng)用該雙重組系統(tǒng)，結(jié)合報(bào)告基因小鼠模型（比如R26-LSL-tdTomato), 實(shí)現(xiàn)特定細(xì)胞群譜系示蹤過(guò)程，滿足X-Dre和Y-CrexERT2同時(shí)表達(dá)陽(yáng)性的限定范圍，使更加精準(zhǔn)有效研究特定器官或組織特異性細(xì)胞譜系示蹤成為可能。

國(guó)內(nèi)中科院周斌課題組應(yīng)用該雙重組系統(tǒng)，成功實(shí)現(xiàn)了靶基因在冠狀動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（Tie2-Dre和Wt1-CrexERT2），或腦血管內(nèi)皮細(xì)胞（Tie-2和Mfsd2a-CrexERT2）的高效及特異性的基因敲除或過(guò)表達(dá)研究。

• 新型誘導(dǎo)性DD-cre小鼠模型的建立，成為未來(lái)Cre-loxP可誘導(dǎo)重組系統(tǒng)的補(bǔ)充

TAM誘導(dǎo)性Cre-ERT2小鼠應(yīng)用中的不足，比如，需要多次給藥，相對(duì)較慢的誘導(dǎo)激活與抑制過(guò)程；以及TAM可能與小鼠內(nèi)源性雌激素受體結(jié)合，導(dǎo)致相關(guān)副作用等，為進(jìn)一步改善該系統(tǒng)，以及尋找更加有效誘導(dǎo)方法，具有其現(xiàn)實(shí)意義。 最近新型誘導(dǎo)性DD-Cre小鼠模型研制應(yīng)用成功，也為Cre-loxP可誘導(dǎo)重組系統(tǒng)應(yīng)用，提供了額外的選擇。

DD技術(shù)的基本原理，是基于來(lái)自人的FKBP12或細(xì)菌二氫葉酸還原酶 (ecDHFR) 的突變去穩(wěn)定域（Destabilizing dormain-DD），與任何感興趣的蛋白（比如Cre) 融合而建立。而合成的含F(xiàn)KBP12或ecDHFR標(biāo)記的新型DD-相關(guān)蛋白，可導(dǎo)致蛋白酶降解過(guò)程。但如此蛋白降解破壞通路，可被抗生素甲氧芐啶（Trimethoprim ，TMP）所阻斷。

DD-Cre小鼠模型是將DD域與Cre基因融合，構(gòu)建成去穩(wěn)定化Cre重組酶系統(tǒng) 的DD-Cre小鼠，且其重組活性由抗生素TMP誘導(dǎo)調(diào)控，即DD-Cre激活重組作用為T(mén)MP依賴(lài)，從而實(shí)現(xiàn)體內(nèi)Cre-loxP重組系統(tǒng)的位點(diǎn)特異性可誘導(dǎo)的靶基因編輯作用。

TMP誘導(dǎo)物價(jià)格便宜、無(wú)毒性、誘導(dǎo)快速、可通過(guò)胎盤(pán)及血腦屏障，且在哺乳動(dòng)物體內(nèi)無(wú)內(nèi)源靶點(diǎn)存在等優(yōu)勢(shì)，使TMP成為穩(wěn)定DD標(biāo)記蛋白的理想誘導(dǎo)物。 因此，體內(nèi)應(yīng)用TMP誘發(fā)蛋白穩(wěn)定作用，有利于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物誘導(dǎo)劑快速傳遞，發(fā)揮其在神經(jīng)系統(tǒng)等周?chē)�組織的高效擴(kuò)散效應(yīng)。

有研究借助R26-CAG-tdTomato或R26 Ai9-tdTomato報(bào)告小鼠，應(yīng)用不同濃度TMP（8～170 ug/g, 每天腹腔注射一次或連續(xù)七次) 誘導(dǎo)后24～48小時(shí)，其重組切割效果達(dá)高峰，且呈現(xiàn)劑量依賴(lài)效應(yīng)。  研究表明，相對(duì)于CreERT2系統(tǒng)，TMP在體內(nèi)誘導(dǎo)效果快，使DD-Cre系統(tǒng)成為具有吸引力與理想的廣泛應(yīng)用于神經(jīng)遺傳研究領(lǐng)域的工具。

當(dāng)然，如同其他方法一樣，DD-Cre技術(shù)也可能出現(xiàn)一定程度的Cre 背景活性。且活性作用也會(huì)受到某些因素的影響，比如，DD融合蛋白的降解率，穩(wěn)定性結(jié)合配體與合適亞細(xì)胞域融合的招募，以及DD表記對(duì)融合蛋白功能的干預(yù)等。

最后，將Cre-loxP 位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)應(yīng)用中，Cre小鼠構(gòu)建策略建議性指導(dǎo)原則及需要考慮的因素概括如下：

（1）. 采用定點(diǎn)敲入基因打靶技術(shù)構(gòu)建新型Cre小鼠品系；

（2）. 如果定點(diǎn)敲入基因位點(diǎn)不是雜合致死基因，建議將Cre定點(diǎn)敲入內(nèi)源相關(guān)基因編碼序列區(qū)域；

（3）. 如果可能的話，將報(bào)告基因也構(gòu)建到新建立的floxed靶基因打靶小鼠；

（4）. Cre小鼠作為靶基因打靶研究的單獨(dú)對(duì)照，以排除Cre小鼠本身引起的非特異性脫靶重組作用; 

（5）. 如果靶基因不是雜合致死基因，可以先建立雜合生殖細(xì)胞基因敲除策略，以提高Cre打靶效率;

（6）. 設(shè)計(jì)合理的PCR特定鑒定引物組合，便于基因型鑒定分析靶基因敲除、野生和特異性靶基因打靶（flexed）等不同情況；

（7）. 應(yīng)用半合子或雜合Cre小鼠，以降低其可能引起的毒性及脫靶效應(yīng)作用；

（8）. 如果有floxed小鼠作為附加實(shí)驗(yàn)對(duì)照，就更加完美；

（9）. 確定誘導(dǎo)劑TAM實(shí)際使用劑量預(yù)實(shí)驗(yàn)的重要性；

（10）. 了解特定Cre小鼠以前實(shí)際應(yīng)用情況，包括其非特異性脫靶、生殖性重組活性、性別及遺傳背景等影響因素；

（11）. 如果需要選擇兩個(gè)，或更多靶基因重組和/或靶基因編輯策略，建議應(yīng)用突變類(lèi)型的loxP序列，比如loxN、lox2271或lox511；以及其他類(lèi)似的Dre-rox位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)等；

（12）. 考慮選擇其他誘導(dǎo)調(diào)控系統(tǒng)，比如，借助抗生素甲氧芐啶（TMP）誘導(dǎo)的DD-Cre新型可調(diào)控系統(tǒng)。

（13）. 條件性Floxed小鼠靶基因2 x loxP間DNA長(zhǎng)度、染色體位置、表觀遺傳修飾、生殖細(xì)胞轉(zhuǎn)錄易接近程度等也可成為Cre作用效率的影響因素。