光纖記錄系統(tǒng)作為常用的研究動(dòng)物神經(jīng)元活動(dòng)與行為關(guān)系的重要工具，對(duì)于研究特定神經(jīng)環(huán)路在不同行為范式中的功能具有重要意義。本文將著重介紹光纖記錄實(shí)驗(yàn)手術(shù)所需器材，手術(shù)步驟以及注意事項(xiàng)，助力實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性的提升。
 

實(shí)驗(yàn)設(shè)備和材料

異氟烷麻醉系統(tǒng)、立體定位儀、數(shù)碼顯微鏡、電極拉制儀、微量注射泵、剃毛工具、手術(shù)刀、眼科鑷、眼科剪、棉簽、碘伏、3%雙氧水，AAV病毒、陶瓷插針、顱骨鉆、鉆頭（0.8mm）、顱釘（M1.0xL2.0mm）、螺絲刀（45*1mm）、生理鹽水、牙托粉水（義齒基托聚合物，自凝型）、紅霉素眼膏、抗生素等。
 

術(shù)前準(zhǔn)備

01

確定目標(biāo)腦區(qū)坐標(biāo)
確定目標(biāo)腦區(qū)位點(diǎn)通常有兩種策略：

• 通過使用立體定位圖譜，尋找目標(biāo)腦區(qū)具體位置，讀取目標(biāo)腦區(qū)深度，矢狀、冠狀坐標(biāo)，最終確定目標(biāo)腦區(qū)的三維坐標(biāo)。
• 通過閱讀參考文獻(xiàn)，獲取方法中涉及目標(biāo)腦區(qū)的坐標(biāo)。文獻(xiàn)中坐標(biāo)常用標(biāo)注：AP：anteroposterior，前囟前后；ML：mediolateral，中縫左右；DV：dorsoventral，顱骨（硬腦膜）平面向下。

*需要注意：文獻(xiàn)中坐標(biāo)選取的Z軸參考點(diǎn)：包括Bregma點(diǎn)、腦膜表面、顱骨表面的Z軸讀值

02

器具消毒、儀器檢查
實(shí)驗(yàn)前使用酒精擦拭手術(shù)器械，檢查各種實(shí)驗(yàn)耗材是否準(zhǔn)備完整。檢查立體定位儀，確保定位儀刻度置零，可以正常工作。
 

03

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物準(zhǔn)備
選取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢查其健康狀況。
 

（▲小鼠顱骨表面示意圖）

 

動(dòng)物手術(shù)

01

動(dòng)物麻醉及固定

1. 小鼠稱重。
2. 在異氟烷誘導(dǎo)盒中麻醉小鼠（4％，1 L / min）。
3. 將小鼠嘴部放在麻醉面罩中。
4. 將小鼠門齒扣在適配器齒棒上，并使用適配器將小鼠固定于立體定位儀上，異氟烷濃度調(diào)整為0.5-1%。
5. 麻醉深度可通過對(duì)腳趾捏合無反應(yīng)（監(jiān)測(cè)腳趾捏合反應(yīng)）來確認(rèn)，手術(shù)期間每20min一次。
6. 剃掉從眼睛到耳朵后面的毛發(fā)。
7. 用棉簽蘸少量碘伏清潔頭部。
8. 在頭皮表面下注入0.1 ml利多卡因，以提供局部鎮(zhèn)痛作用。
9. 保護(hù)眼睛避光：涂抹紅霉素眼膏。

 

02

暴露顱骨

1. 從前到后（眼睛之間到顱骨后部）做切口。
2. 用蘸有生理鹽水的棉簽擦拭切口。
3. 找到并標(biāo)記Bregma（前囟點(diǎn)）位置。
4. 確保頭骨干凈（沒有血液，毛皮或組織）并且干燥（使用干燥的棉簽吸生理鹽水或血液）。
5. 將連接好玻璃電極的微量注射泵夾持到定位儀上。
6. 調(diào)節(jié)顱骨水平：玻璃電極針尖接觸Bregma點(diǎn)，將該點(diǎn)設(shè)定為原點(diǎn)，而后測(cè)量Bregma點(diǎn)左右兩側(cè)旁開2.3mm處顱骨的高度差，小于0.03mm則認(rèn)為左右顱骨水平，大于0.03mm則需要調(diào)節(jié)耳桿的高度來調(diào)整水平，前后方向測(cè)量Bregma點(diǎn)和Lambda點(diǎn)的高度差，也需小于0.03mm，若大于0.03mm則上下調(diào)整鼻夾的高度（注意：移動(dòng)顱骨后需要重新定Bregma點(diǎn)）。
7. 標(biāo)記目標(biāo)位置。
8. 在目標(biāo)標(biāo)記點(diǎn)處用顱鉆進(jìn)行開顱并挑開硬腦膜。此外還需鉆兩個(gè)預(yù)留孔，用于埋植顱釘。如果鉆孔過程發(fā)生出血，使用棉簽清潔血液，然后使用一塊可吸收的海綿來止血。
9. 用鹽水浸濕的海綿覆蓋開顱部位。

 

03

病毒注射

1. 從冰箱中取出病毒。
2. 設(shè)置微量注射泵參數(shù)（例如吸取體積400nL，速度為800nL/min，模式調(diào)為吸入Withdraw）吸取病毒，使其尖端接觸Bregma點(diǎn)并設(shè)定原點(diǎn)。
3. 取走開顱部位濕海綿。
4. 將玻璃電極針移動(dòng)至目標(biāo)位點(diǎn)上方，然后下針至目標(biāo)位點(diǎn)（下針過程保持勻速緩慢），設(shè)置注射泵參數(shù)（體積400nL，速度40nL/min，模式調(diào)為泵出Infuse）,開始注射病毒。
5. 注射完成后靜置10min，10min后將微量注射器抬起。
6. 瑞沃德R480玻璃微電極注射泵搭配立體定位儀，對(duì)腦部可精準(zhǔn)進(jìn)行病毒或示蹤劑注射。

 

04
埋植顱釘

顱釘（小螺絲）植入深度約0.5mm左右，避免過深壓迫大腦，過淺固定不牢固。固定顱釘?shù)念A(yù)留孔需離光纖埋植的位置遠(yuǎn)一些，防止顱釘埋好之后留下的空間太小，導(dǎo)致光纖不好埋植。顱骨鉆孔完成后，還需清理顱骨表面的顱骨碎屑，并用生理鹽水清洗，保證顱骨表面清晰干凈。
 

（▲顱釘植入）

05

陶瓷插針植入

1. 在病毒注射后，從腦立體定位儀上取下注射泵。
2. 將光纖插針用夾持器固定到腦立體定位儀上。
3. 固定光纖之后需要用光纖尖部接觸Bregma點(diǎn)，重新移動(dòng)至目標(biāo)位點(diǎn)上方（光纖插針應(yīng)位于鉆頭產(chǎn)生的窗口上方）。
4. 將光纖插針下降到適當(dāng)?shù)腄V坐標(biāo)，高于病毒注射位置200-300μm。
5. 用牙科水泥固定光纖。注意：牙科水泥輕輕涂抹在光纖纖維的底部周圍。
6. 待水泥完全凝固后，小鼠轉(zhuǎn)移至飼養(yǎng)籠中單獨(dú)飼養(yǎng)，術(shù)后監(jiān)測(cè)健康情況。

待2-3周鈣熒光病毒表達(dá)后，將光纖與小鼠頭部陶瓷插針連接，使用光纖記錄系統(tǒng)采集動(dòng)物在行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中大腦的鈣熒光信號(hào)，通過分析軟件處理鈣熒光信號(hào)數(shù)據(jù)，并結(jié)合行為學(xué)視頻對(duì)動(dòng)物的行為進(jìn)行分析。
 

（▲光纖記錄實(shí)驗(yàn)）
 

光纖記錄實(shí)驗(yàn)手術(shù)中所需器材、手術(shù)步驟和注意事項(xiàng)已全部講解，后續(xù)我們還有更多光纖記錄干貨，請(qǐng)持續(xù)關(guān)注哦~