主動脈瓣狹窄（AVS）是最常見的瓣膜性心臟病，由于主動脈瓣瓣葉增厚和鈣化，導(dǎo)致主動脈瓣進(jìn)行性狹窄，是心力衰竭和心血管死亡率增加的主要原因。omega-3多不飽和脂肪酸（n-3 PUFAs）在心血管預(yù)防方面具有有益作用，n-3 PUFAs作為合成特殊促分解介質(zhì)的底物，在心血管疾病中具有抗炎、促分解和組織修飾特性。然而，n-3PUFAs和專門的促分解介質(zhì)對AVS的影響尚不明確，Peter Sjovall研究團(tuán)隊對96例主動脈瓣置換術(shù)患者的三尖瓣主動脈瓣進(jìn)行脂質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，并以Apoe^-/-和C57BL/6J小鼠主動脈瓣線損傷為模型確定n-3PUFAs衍生的特殊促分解介質(zhì)（SPMs）通過RvE1/ChemR23軸介導(dǎo)AVS進(jìn)展的機(jī)制，提示n-3 PUFAs治療可能為預(yù)防AVS提供新的治療機(jī)會。

 
人主動脈瓣n-3不飽和脂肪酸含量

對21例非鈣化主動脈瓣組織進(jìn)行氣相色譜分析測定人主動脈瓣中的脂肪酸含量，對比來自同一主動脈瓣的非鈣化組織和鈣化組織發(fā)現(xiàn)，非鈣化部分的HS-omega-3指數(shù)（n-3 PUFA含量的整體測量）明顯高于主動脈瓣鈣化部分（圖1B）。然而，與快速進(jìn)展的AVS患者相比，有緩慢AVS進(jìn)展史的患者在非鈣化主動脈瓣區(qū)域顯示更高的HSomega- 3（圖1C）。此外，高HS -3指數(shù)和低HS-3指數(shù)患者的轉(zhuǎn)錄組主成分分析結(jié)果顯示，在非鈣化和鈣化的人主動脈瓣組織中存在差異（圖1D）。

Resolvins 和白三烯在鈣化的主動脈瓣組織中失調(diào)

由于主動脈瓣脂肪酸含量的變化可能會改變下游脂質(zhì)介質(zhì)形成的底物可用性，采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行靶向脂質(zhì)介質(zhì)的研究，在人非鈣化和鈣化瓣膜組織中鑒定了2個n-3 PUFA衍生的SPMs, DHA衍生的RvD3和EPA衍生的RvE1，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）定量結(jié)果顯示，與非鈣化組織相比，鈣化組織中的RvE1水平顯著降低（圖2A和2B），且鈣化組織中促炎的n-6 PUFA衍生脂質(zhì)介質(zhì)白三烯B4（LTB4）明顯高于非鈣化組織（圖2D）。

RvE1受體ChemR23在人主動脈瓣中表達(dá)，RvE1在體外降低人瓣膜間質(zhì)細(xì)胞鈣化

在64例人主動脈瓣的非鈣化組織中研究了SPM受體ChemR23、GPR18、GPR32和ALX/FPR2的mRNA水平。基因表達(dá)分析顯示，編碼RvE1的ChemR23受體是人類主動脈瓣主要的SPM受體（圖3A），此外，免疫組化檢測到ChemR23蛋白表達(dá)廣泛分布于人鈣化和非鈣化區(qū)域主動脈瓣的纖維層、海綿體層、心室層（圖3B）。通過免疫熒光與瓣膜間質(zhì)細(xì)胞（VIC）標(biāo)記物平滑肌肌動蛋白和波形蛋白共定位（圖3C-D）�？紤]到ChemR23在VIC中的表達(dá)以及鈣化瓣膜組織中RvE1水平的降低，接下來研究了RvE1對高磷酸鹽介質(zhì)誘導(dǎo)VIC鈣化的影響，結(jié)果顯示，與對照相比，RvE1顯著降低了人VIC的鈣化（圖3E-F）。

Fat-1^tg×Apoe^−/−小鼠主動脈瓣瓣葉中n-3 PUFA濃度較高

構(gòu)建秀麗隱桿線蟲基因 Fat-1^tg （編碼一種將n-6轉(zhuǎn)化為n-3PUFAs的去飽和酶）在Apoe^−/−小鼠中表達(dá)使得內(nèi)源性產(chǎn)生n-3 PUFA，并借助飛行時間二次離子質(zhì)譜對 Fat-1^tg×Apoe^−/−和Apoe^−/−小鼠的主動脈瓣葉區(qū)域測量 n-3 PUFA 和 n-6 PUFA。光學(xué)顯微鏡觀察主動脈根部，發(fā)現(xiàn)組織表面有磷脂酰乙醇胺，動脈粥樣硬化斑塊區(qū)域有膽固醇，無組織區(qū)域有血紅素，表明有血液殘留（圖4A-C）。然后通過從專門對應(yīng)于瓣葉區(qū)域的特定部位生成質(zhì)譜來提取空間解析的脂肪酸數(shù)據(jù)（圖4B-C）。對瓣葉中心區(qū)域所有質(zhì)譜中脂肪酸信號強(qiáng)度的分析表明，與Apoe^−/−小鼠相比，F(xiàn)at-1^tg×Apoe^−/−小鼠n-3 PUFA（EPA，二十二碳五烯酸）的相對濃度顯著升高，而 n-6 PUFA（花生四烯酸）的相對濃度顯著降低（圖4D-E），且Fat-1^tg×Apoe^−/−小鼠心室心肌HS-omega-3指數(shù)明顯升高（圖4F）。

Fat-1^tg中止或ChemR23^−/−會增加Apoe^−/−小鼠的超聲心動圖進(jìn)展

在 52、64 和 72 周齡分別評估經(jīng)主動脈峰值速度 （Vmax） 和主動脈瓣尖瓣分離，提示Apoe^−/−小鼠的 Vmax 隨著年齡逐漸增加（圖5A）。Fat-1^tg×Apoe^−/−小鼠表現(xiàn)出 Vmax 顯著降低（圖 5A），主動脈血管顯著增加，與非轉(zhuǎn)基因 Apoe^−/−小鼠相比，72 周時瓣尖分離和左心室質(zhì)量減少（圖 5B）。根據(jù)對人主動脈瓣分析獲得的結(jié)果，RvE1/ChemR23 軸被Apoe^−/−模型中 ChemR23 的基因缺失而消除，以確定n-3PUFAs對主動脈瓣產(chǎn)生有益影響的機(jī)制。與Apoe^−/−×ChemR23^+/+小鼠相比，Apoe^−/−×ChemR23^−/−小鼠表現(xiàn)出 Vmax 顯著增加、瓣尖分離減少，將 ChemR23 受體作為主動脈瓣保護(hù)的傳感器（圖5A-B）。為了確定增加的 n-3 PUFAs的有益作用是否通過ChemR23 轉(zhuǎn)導(dǎo)，在Apoe^−/−×ChemR23^−/−小鼠中引入 Fat-1^tg。在 Fat-1^tg Apoe^−/−（降低 Vmax 和增加主動脈瓣分離）中觀察到的有益作用在 ChemR23^−/−小鼠中完全消失（圖 5A-B），表明n-3 PUFAs衍生的RvE1信號通過ChemR23在疾病進(jìn)展發(fā)揮直接作用。Vmax與尖瓣分離呈負(fù)相關(guān)，提示Vmax 增加是尖瓣分離減少的結(jié)果。

Fat-1^tg 減少主動脈瓣葉面積，ChemR23^-/-增加 Apoe^-/-小鼠的主動脈瓣葉面積

形態(tài)學(xué)分析提示Fat-1^tg通過 ChemR23 對主動脈瓣葉面積產(chǎn)生有益影響。與非轉(zhuǎn)基因小鼠相比，F(xiàn)at-1^tg Apoe^-/-小鼠的主動脈瓣葉面積減少。相反，與 Apoe^-/-×ChemR23^+/+小鼠相比，Apoe^-/-×ChemR23^-/-主動脈瓣瓣葉面積顯著增加（圖6A）。此外，在調(diào)整后的模型中，主動脈瓣瓣葉面積與主動脈瓣瓣葉厚度顯著相關(guān)（圖6B），與超聲心動圖測量的Vmax顯著相關(guān)（圖6C），與尖瓣分離顯著相反（圖6D）。定量變量的不顯著偏相關(guān)提示基因型作為這些關(guān)聯(lián)的預(yù)測因子（圖6B-D）。

Fat-1^tg 減少小葉鈣化而ChemR23^-/-增加Apoe^-/-小鼠的小葉鈣化

由于鈣化是人AVS的主要成分，且與人類主動脈瓣非鈣化區(qū)相比，鈣化區(qū)n-3 PUFA含量和RvE1形成減少，因此通過茜素紅染色隨后分析4組小鼠主動脈瓣瓣葉鈣化情況，結(jié)果表明，與 Apoe^-/-ChemR23^+/+小鼠相比，F(xiàn)at-1^tg Apoe^-/-×ChemR23^+/+小鼠的鈣化顯著降低；與 Apoe^-/-×ChemR23^+/+小鼠相比，Apoe^-/-×ChemR23^-/-小鼠無論 Fat-1^tg存在與否都表現(xiàn)出顯著更高的小葉鈣化（圖7A）。此外，小葉鈣化與主動脈瓣小葉面積、Vmax 和瓣葉分離的相關(guān)性在調(diào)整后的模型中更為顯著。

Fat-1^tg誘導(dǎo)M2巨噬細(xì)胞極化，ChemR23與M2巨噬細(xì)胞標(biāo)志物相關(guān)

因巨噬細(xì)胞代表狹窄瓣膜中的主要免疫細(xì)胞群，而且巨噬細(xì)胞極化是消除炎癥的關(guān)鍵步驟，對小鼠主動脈瓣膜中的不同巨噬細(xì)胞標(biāo)記物進(jìn)行免疫組化。雖然含有 CD68 的小葉面積比例在各組之間無顯著差異（圖 7B），但在 Fat-1^tg Apoe^-/-小鼠中觀察到 M2 巨噬細(xì)胞標(biāo)志物 CD206 和精氨酸酶-1 的比例顯著增加（圖7C-D），且在ChemR23^-/-的小鼠中丟失（圖 7D）。

與小鼠瓣膜的研究結(jié)果一致，人主動脈瓣膜鈣化和非鈣化部分的ChemR23和CD206 mRNA水平之間存在強(qiáng)相關(guān)性，且ChemR23與M2巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD163, CD209, CD200R1和血紅素加氧酶1呈正相關(guān)。

ChemR23^-/-導(dǎo)致主動脈瓣線損傷后主動脈瓣Vmax 升高和增厚增加

在高膽固醇血癥的情況下，n-3 PUFAs通過ChemR23降低主動脈瓣阻塞、厚度和鈣化，因此，使用血脂正常的 ChemR23^+/+（C57BL/6J） 和 ChemR23^-/-小鼠，并應(yīng)用輕度損傷的主動脈瓣線損傷方案，建立第二個主動脈瓣疾病（AVD）模型。與Apoe^-/-小鼠的結(jié)果一致，與 ChemR23^+/+小鼠相比，ChemR23^-/-小鼠在主動脈瓣損傷16 周后Vmax顯著升高，組織形態(tài)分析顯示，與ChemR23^+/+小鼠相比，ChemR23^-/-小鼠的主動脈瓣葉厚度顯著增加。

小結(jié)

本研究首次揭示人主動脈瓣n-3 PUFAs含量的增加與更少的鈣化和特定的轉(zhuǎn)錄模式相關(guān)，主動脈瓣n-3 PUFAs降低體內(nèi)AVD，這在血流動力學(xué)、形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)及不同的小鼠模型中都一致。進(jìn)一步破譯了n-3 PUFA 衍生的 RvE1 及其受體 ChemR23 成為抑制 AVD 進(jìn)展的關(guān)鍵軸，本研究的結(jié)果將 n-3 PUFA/RvE1/ChemR23 軸作為一種新的潛在治療方案進(jìn)行臨床評估，以減緩 AVD 進(jìn)展和改善AVD患者預(yù)后。

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參考文獻(xiàn)

Gonzalo Artiach, Peter Sjovall, et al. Omega-3 Polyunsaturated Fatty Acids Decrease Aortic Valve Disease Through the Resolvin E1 and ChemR23 Axis. Circulation. 2020;142:776–789. DOI: 10.1161/CIRCULATIONAHA.119.041868.

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