Transcriptome analysis of Pinus halepensis under drought stress and during recovery

干旱脅迫下黑松恢復(fù)期的轉(zhuǎn)錄組分析

林木利用各種策略來應(yīng)對干旱脅迫，這些策略涉及復(fù)雜的分子機制。黑松分布于整個地中海盆地，是最耐旱的松種之一。為了破譯黑松用來抵御干旱的分子機制，我們進行了大規(guī)模的生理和轉(zhuǎn)錄組分析。本文從一個生長條件不理想的半干旱地區(qū)選擇了一棵成熟的樹木進行扦插繁殖。然后使用高通量實驗系統(tǒng)連續(xù)監(jiān)測整個植物的蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度和VPD。在氣孔前反應(yīng)、部分氣孔關(guān)閉、最小蒸騰、灌水后、部分恢復(fù)和完全恢復(fù)六個生理階段對植物的轉(zhuǎn)錄組進行了檢測。在每個階段，將暴露于干旱處理的植物的數(shù)據(jù)與從灌溉良好的對照植物收集的數(shù)據(jù)進行比較。干旱脅迫下的黑松轉(zhuǎn)錄組是使用雙端 RNA-seq 創(chuàng)建的。在經(jīng)過干旱處理的樹木和對照樹木之間，總共鑒定出約6000個差異表達的非冗余轉(zhuǎn)錄本。聚類分析揭示了與光合作用、活性氧 (ROS) 通過抗壞血酸 (AsA) 谷胱甘肽循環(huán)清除、脂肪酸和細胞壁生物合成、氣孔活性以及類黃酮和萜類化合物的生物合成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄物的應(yīng)激誘導(dǎo)下調(diào)。上調(diào)的過程包括葉綠素降解、通過AsA非依賴性硫醇介導(dǎo)的途徑清除活性氧、脫落酸反應(yīng)和熱休克蛋白、thaumatin和exordium的積累。干旱恢復(fù)誘導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的強烈轉(zhuǎn)錄，尤其是逆轉(zhuǎn)錄病毒相關(guān)轉(zhuǎn)座子Tnt1-94。干旱相關(guān)轉(zhuǎn)錄組闡明了該物種對干旱和恢復(fù)的動態(tài)反應(yīng)，并揭示了新的機制。

圖1.干旱和恢復(fù)過程中黑松全株蒸騰速率和冠層氣孔導(dǎo)度的變化

本文評估了在不同灌溉制度下生長的植物的生理反應(yīng)。最初，對植物進行7天的充分灌溉，然后暫停灌溉46天，以施加越來越大的脅迫壓力，然后恢復(fù)灌溉。監(jiān)測兩個主要參數(shù)以確定干旱嚴重程度：中午的E和中午的gsc。與停止灌溉19天后的對照植物相比，干旱處理導(dǎo)致第26天中午E和gsc顯著減少（圖1）。盡管圖1B中的E是五個重復(fù)的平均值，圖1C中的gsc是單個植物的，但在整個實驗過程中E的模式與gsc的模式匹配，并且這兩個參數(shù)與VPD的每日變化相關(guān)（圖1）。隨著干旱的持續(xù)，干旱處理的樹木的gsc從第21天的319逐漸下降到第26天的171，并在干旱期結(jié)束時降至94 mmol s-1 g-1（圖1C）。恢復(fù)灌溉后，經(jīng)干旱處理的樹木的E和gsc恢復(fù)到干旱處理前記錄的水平，表明干旱處理并非結(jié)束。在gsc的基礎(chǔ)上，選擇了兩株干旱處理和兩株灌溉（對照）樹木，在六個不同生理階段進行分子研究。選擇的轉(zhuǎn)錄組分析階段（圖1C）如下：（D1）第 21 天的氣孔前反應(yīng)，319 gsc；(D2) 第27天氣孔部分關(guān)閉，171gsc；(D3) 第 53 天的最小蒸騰作用，94 gsc；(D4) 在第54天用116gsc 灌溉后；(D5) 在第56天部分恢復(fù)，271gsc； (D6) 在第69天完全恢復(fù)，gsc為523mmol s-1g-1。

圖2.響應(yīng)干旱和恢復(fù)的差異表達（DE）轉(zhuǎn)錄本

在上述六個生理階段對干旱處理和對照樹木的基因表達譜分析使我們能夠分析在干旱處理植物和對照植物之間差異表達的轉(zhuǎn)錄本（圖2）。一般來說，隨著干旱的進展，DE轉(zhuǎn)錄物的數(shù)量逐漸增加，在恢復(fù)過程中逐漸減少。轉(zhuǎn)錄下調(diào)在干旱響應(yīng)中占主導(dǎo)地位，而在重新澆水和整個恢復(fù)期間，轉(zhuǎn)錄上調(diào)占主導(dǎo)地位（圖2）。在 D1 階段的干旱處理和對照克隆中僅鑒定出 27 個上調(diào)和 27 個下調(diào)的轉(zhuǎn)錄本。與在 D2 階段收集的生理數(shù)據(jù)一致，此時注意到 gsc 減少（圖2B），223個轉(zhuǎn)錄本上調(diào)，而370個轉(zhuǎn)錄本下調(diào)。在D3階段，在觀察到的蒸騰速率和gsc最低時（圖1B和3B），注意到878個轉(zhuǎn)錄本的上調(diào)和1490個轉(zhuǎn)錄本的下調(diào)。再澆水幾個小時后，在D4階段，2071個轉(zhuǎn)錄本上調(diào)，而1505個轉(zhuǎn)錄本下調(diào)。這些數(shù)字在D5階段（部分恢復(fù)）減少到537個上調(diào)轉(zhuǎn)錄本和510個下調(diào)轉(zhuǎn)錄本。上調(diào)轉(zhuǎn)錄本的數(shù)量在 D6 階段（完全恢復(fù)）急劇增加至1275，而此時下調(diào)轉(zhuǎn)錄本的數(shù)量已下降至336（圖 2A）�？偣舶l(fā)現(xiàn)黑松轉(zhuǎn)錄組包含 6035個DE轉(zhuǎn)錄本，其中2466個先前報道過，3567個是從頭組裝的。轉(zhuǎn)錄組包括1035 (17%) 個無注釋的重疊群和 650 (10.1%) 個與逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座元件相關(guān)的重疊群。為了識別不同生理階段常見的轉(zhuǎn)錄本，分別為D2-D6階段的上調(diào)和下調(diào)轉(zhuǎn)錄本生成了兩個維恩圖（圖2C和D）。下調(diào)轉(zhuǎn)錄本的最高重疊在階段D3和D4之間，這表明 >50% 的常見轉(zhuǎn)錄本表明重新澆水后逐漸恢復(fù)。上調(diào)轉(zhuǎn)錄物的最高重疊D4和D6之間，其中大多數(shù)是逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子。上調(diào)轉(zhuǎn)錄本的第二高重疊在D3和D4之間，表明重新澆水后逐漸恢復(fù)。

圖3.干旱和恢復(fù)期間黑松中反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的表達模式

集群20主要由在D4和D6階段上調(diào)的轉(zhuǎn)錄本主導(dǎo)。該集群包括1405個轉(zhuǎn)錄本，其中646個轉(zhuǎn)錄本沒有注釋。該集群還包括與逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子相關(guān)的489個轉(zhuǎn)錄本。這些誘導(dǎo)的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子屬于HAT、Ty1、Ty3 和Tf2家族（圖6）。然而，具有243個相關(guān)轉(zhuǎn)錄本的最主要的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子是Tnt1-94（圖6B 和C）。在該簇的其余275個轉(zhuǎn)錄本中，8個是TF，44個與光合作用相關(guān)，22個過氧化物酶-64轉(zhuǎn)錄本，18個核糖核酸酶 (RNase) H轉(zhuǎn)錄本和10個內(nèi)切核糖核酸酶切丁酶轉(zhuǎn)錄本。在簇6和27中看到了28個逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座元件的類似模式，它們總共包括130個轉(zhuǎn)錄本。