mRNA疫苗的體外穩(wěn)定性

正如之前在背景介紹中提到的，目前已批準(zhǔn)的 mRNA疫苗流通的主要障礙之一是它們必須以冷凍形式儲存。在 2–8 °C 的溫度下，輝瑞/BioNTech 和 Moderna 疫苗分別可穩(wěn)定保存 5 天和 30 天，兩家公司都為終端使用提供了詳細(xì)的處理說明。有趣的是，據(jù)報道 CureVac 的候選疫苗在冰箱溫度和 -60 °C 下可穩(wěn)定 3 個月。這些是目前發(fā)布了mRNA-LNP長期儲存條件的制造商，這種苛刻的溫度要求嚴(yán)重影響了這些疫苗的儲存、運輸和流通。然而，迄今為止，在公開資料中幾乎沒有關(guān)于優(yōu)化mRNA 疫苗穩(wěn)定性的信息。本節(jié)旨在概述影響 mRNA-LNP 疫苗成分穩(wěn)定性的因素，并討論分析評價這種穩(wěn)定性的方法。

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mRNA穩(wěn)定性

強(qiáng)烈影響所需儲存條件的主要因素是 mRNA 的穩(wěn)定性。如上文2.1 節(jié)所述，mRNA 分子的結(jié)構(gòu)經(jīng)過專門設(shè)計可以用于增加體內(nèi)靶抗原的翻譯。mRNA 的特殊性在于，即使是長 mRNA 鏈（通常長度在 1000 到 5000 個核苷酸之間）中的一個核苷酸發(fā)生變化（鏈斷裂或堿基氧化）便會導(dǎo)致翻譯終止。這使得 mRNA 疫苗與其他疫苗完全不同，在其他疫苗中，抗原的微小變化不一定對其功效產(chǎn)生顯影響。因此，對于 mRNA 疫苗，監(jiān)測整個分子的完整性是至關(guān)重要的。

mRNA 降解的方式有多種，可以分為化學(xué)和物理降解�；瘜W(xué)降解包括 mRNA 分子中化學(xué)鍵的改變。物理不穩(wěn)定性包括變性（二級和三級結(jié)構(gòu)的喪失），與變性對蛋白質(zhì)生物制劑活性的影響不同，物理不穩(wěn)定性對mRNA的影響可能不太明顯。然而，變性還包括聚集和沉淀等變化，這些變化會影響mRNA的翻譯表達(dá)。在一篇關(guān)于核酸穩(wěn)定性的綜述中，Pogocki 和 Schöneich 指出化學(xué)降解在siRNA降解中的影響比物理不穩(wěn)定性更大，對于鏈長更長的 mRNA來說可能更是如此。

mRNA在體外的化學(xué)降解主要包括水解和氧化，水解主要是發(fā)生在mRNA 分子骨架的磷酸二酯鍵（圖5 ）。核糖上的2' OH 基團(tuán)起著至關(guān)重要的作用，因為導(dǎo)致 mRNA 鏈斷裂的酯交換反應(yīng)起始于磷酸酯鍵上的 2'OH 基團(tuán)的親核進(jìn)攻導(dǎo)致 P-O5' 酯鍵斷裂（圖5）。這個過程需要水，可以被核酸酶催化，也可以被 mRNA 分子本身和其他外源因素如酸和堿催化。在有關(guān) mRNA 水解的兩篇文獻(xiàn)中，作者指出 mRNA 的堿基序列和二級結(jié)構(gòu)會影響水解速率。具體而言，堿基堆積可能會降低磷酸二酯鍵的裂解速率，可以小化 mRNA 分子的“平均未配對概率”。可以使用專門設(shè)計的算法來選擇可以形成大雙鏈區(qū)域的單鏈 mRNA 的核苷酸序列。據(jù)稱，采用這種方法優(yōu)化后，體外穩(wěn)定性得到了改善。

CureVac、輝瑞/BioNTech 和 Moderna 疫苗之間的區(qū)別在于后兩者具有 1-甲基-假尿苷的單核苷摻入。之前的一項研究表明，這種修飾提高了 RNA 二級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。CureVac 采用提高GC比例策略，具有類似的效果。

圖5 通過 2',3'-環(huán)狀磷酸酯，堿基催化RNA分子內(nèi)的磷酸二酯鍵水解、B表示Brønsted堿。

相反，氧化會影響堿基，并在較小程度上影響mRNA 核糖單位的糖基團(tuán)。氧化可導(dǎo)致堿基裂解、鏈斷裂和 mRNA 二級結(jié)構(gòu)的改變。然而，如前所述，水解似乎被認(rèn)為是驅(qū)動 mRNA 降解的關(guān)鍵因素。

原文文獻(xiàn)：

Linde,S;Dominik ,W;Jayesh A. K;Rein ,V;Gideon ,K;Wim ,J;Daan J.A. C.mRNA-lipid nanoparticle COVID-19 vaccines: Structure and stability.International Journal of Pharmaceutics.2021,601,120586

參考文獻(xiàn)來源：    

1. Abdelwahed, W., Degobert, G., Stainmesse, S., Fessi, H., 2006. Freeze-drying ofnanoparticles: Formulation, process and storage considerations. Adv. Drug Deliv.Rev. 58 (15), 1688–1713. https://doi.org/10.1016/j.addr.2006.09.017.

2. Yanez Arteta, M., Kjellman, T., Bartesaghi, S., Wallin, S., Wu, X., Kvist, A.J.,Dabkowska, A., Sz´ekely, N., Radulescu, A., Bergenholtz, J., Lindfors, L., 2018. Successful reprogramming of cellular protein production through mRNA delivered

by functionalized lipid nanoparticles. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 115 (15),E3351–E3360. https://doi.org/10.1073/pnas.1720542115.

3. Ayat, N.R., Sun, Z., Sun, D.a., Yin, M., Hall, R.C., Vaidya, A.M., Liu, X., Schilb, A.L.,Scheidt, J.H., Lu, Z.-R., 2019. Formulation of biocompatible targeted ECO/siRNAnanoparticles with long-term stability for clinical translation of RNAi. Nucleic AcidTher. 29 (4), 195–207. https://doi.org/10.1089/nat.2019.0784.

4. Baden, L.R., El Sahly, H.M., Essink, B., Kotloff, K., Frey, S., Novak, R., Diemert, D.,Spector, S.A., Rouphael, N., Creech, C.B., McGettigan, J., Khetan, S., Segall, N.,Solis, J., Brosz, A., Fierro, C., Schwartz, H., Neuzil, K., Corey, L., Gilbert, P.,Janes, H., Follmann, D., Marovich, M., Mascola, J., Polakowski, L., Ledgerwood, J.,Graham, B.S., Bennett, H., Pajon, R., Knightly, C., Leav, B., Deng, W., Zhou, H.,Han, S., Ivarsson, M., Miller, J., Zaks, T., 2021. Efficacy and safety of the mRNA-1273 SARS-CoV-2 vaccine. N. Engl. J. Med. 384 (5), 403–416. https://doi.org/10.1056/NEJMoa2035389.

5. Ball, R.L., Bajaj, P., Whitehead, K.A., 2016. Achieving long-term stability of lipidnanoparticles: examining the effect of pH, temperature, and lyophilization. Int. J.Nanomed. 12, 305–315. https://doi.org/10.2147/IJN.S123062.

6. Bloom, K., van den Berg, F., Arbuthnot, P., 2020. Self-amplifying RNA vaccines forinfectious diseases. Gene Ther. 1–13 https://doi.org/10.1038/s41434-020-00204-y.Brader, M.L., Williams, S.J., Banks, J.M., Hui, W.H., Zhou, Z.H., Jin, L., 2021.

7. Encapsulation state of messenger RNA inside lipid nanoparticles. Biophys. J. https://doi.org/10.1016/j.bpj.2021.03.012.

8. Brisco, M.J., Morley, A.A., 2012. Quantification of RNA integrity and its use formeasurement of transcript number. e144–e144 Nucleic Acids Res. 40. https://doi.

org/10.1093/nar/gks588.

9.Burke, P.A., Gindy, M.E., Mathre, D.J., Kumar, V., Prud’homme, R.K., 2013. Preparationof Lipid Nanoparticles. US 2013/0037977.

10. Buschmann, M.D., Carrasco, M.J., Alishetty, S., Paige, M., Alameh, M.G., Weissman, D.,2021. Nanomaterial delivery systems for mRNA vaccines. Vaccines 9 (1), 65. https://doi.org/10.3390/vaccines9010065.