目前可用于生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的生物相容性SWIR熒光探針數(shù)量非常有限。在近紅外和SWIR熒光探針中，吲哚青綠(ICG)是美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)用于臨床的唯一熒光染料，在830納米具有熒光最大值，也可以在SWIR區(qū)域發(fā)射，然而，只有少數(shù)關(guān)于ICG的SWIR熒光分子成像用于可視化活體系統(tǒng)中的癌性腫瘤的報(bào)告。在這篇論文中，作者描述了基于ICG的SWIR熒光分子成像用于小鼠腫瘤的光學(xué)診斷。

作者使用了四種類型的單克隆抗體：抗HER2抗體(Herceptin)、抗EGFR抗體(Erbitux)、抗VEGFR-2抗體(Cyramza)、和抗PD-L1抗體(anti-PD-L1 ab)制備了四種ICG-抗體共軛物，然后，應(yīng)用基于ICG的SWIR熒光分子成像技術(shù)，對小鼠乳腺和皮膚腫瘤進(jìn)行了高靈敏度的光學(xué)檢測，發(fā)現(xiàn)設(shè)計(jì)的SWIR分子成像探針能特異性地積累到乳腺和皮膚腫瘤，并且它們的SWIR熒光圖像(> 1000納米)顯示出比在830納米拍攝的近紅外腫瘤圖像高1.5-2.0倍的對比度，由于其高對比度圖像，盡管ICG的SWIR熒光發(fā)射遠(yuǎn)弱于其NIR熒光發(fā)射，但I(xiàn)CG-抗體共軛物對于尺寸小于幾毫米的小腫瘤的SWIR光學(xué)檢測具有足夠的靈敏度，因此使用ICG-抗體共軛物的SWIR熒光成像能夠定量分析腫瘤大小的變化。此外，作者的研究表明，使用ICG-抗體共軛物的SWIR熒光成像可用于闡明體內(nèi)癌癥特異性膜蛋白HER2、EGFR、VEGFR-2和PD-L1的表達(dá)水平。而且由于ICG從腫瘤發(fā)出的熒光輻射在一個(gè)月內(nèi)保持穩(wěn)定，應(yīng)用 SWIR熒光成像能夠定量分析抗癌藥物Kadcyla治療腫瘤的大小變化，進(jìn)而評估抗癌療效。最終，作者認(rèn)為使用ICG-抗體共軛物的SWIR熒光分子成像有潛力用于醫(yī)學(xué)和臨床領(lǐng)域的癌性腫瘤的光學(xué)診斷。

首先，作為腫瘤靶向探針，作者分別用Herceptin、Erbitux、Cyramza和抗PD-L1抗體制備了四種ICG-抗體共軛物。（備注：鑒于細(xì)胞成像常規(guī)熒光顯微鏡在近紅外區(qū)(< 700 nm)的靈敏度較低，作者使用發(fā)射可見光的Alexa488-抗體共軛物代替ICG-抗體共軛物）

圖1:  (a)染料的N-琥珀酰亞胺酯衍生物(Dye-NHS)與抗體結(jié)合的示意圖。染料-NHS與抗體分子輕鏈和重鏈的氨基結(jié)合。(b)Alexa488和ICG結(jié)合Herceptin后的吸收光譜。
 

接下來，作者發(fā)現(xiàn)使用ICG-抗體共軛物的SWIR熒光成像可用于闡明體內(nèi)癌癥特異性膜蛋白HER2、EGFR、VEGFR-2和PD-L1的表達(dá)水平，對A431和KPL-4細(xì)胞進(jìn)行了western blotting analysis（蛋白質(zhì)印跡分析）(圖2a)。結(jié)果顯示，KPL-4細(xì)胞過度表達(dá)所有的蛋白質(zhì)：EGFR，HER2，VEGFR-2和PD-L1，而A431細(xì)胞除了EGFR、VEGFR-2和PD-L1外，不過度表達(dá)HER2。對A431和KPL-4細(xì)胞進(jìn)行熒光成像顯示Alexa 488–Herceptin染色KPL-4細(xì)胞的膜表面，其熒光比A431細(xì)胞強(qiáng)得多(圖2b)。在Alexa 488–Erbitux的情況下，A431和KPL-4細(xì)胞的膜表面都被染色(圖2b)。這一觀察與A431和KPL-4細(xì)胞的HER2和EGFR表達(dá)水平一致(圖2a)。Alexa 488–Cyramza和Alexa 488–抗PD-L1 ab也對A431和KPL-4細(xì)胞膜進(jìn)行了染色，盡管它們的熒光發(fā)射比Alexa 488–Herception和Alexa 488–Erbitux染色的弱(圖S4)。細(xì)胞成像顯示A431和KPL-4細(xì)胞在其細(xì)胞表面表達(dá)膜蛋白HER2、EGFR、VEGFR-2和PD-L1，盡管它們在A431和KPL-4細(xì)胞中的表達(dá)水平不同。

圖2: (a)A431和KPL-4細(xì)胞中HER2、EGFR、VEGFR-2和PD-L1表達(dá)水平的蛋白質(zhì)印跡分析。(b)A431和KPL-4細(xì)胞用Alexa488-Herceptin和Alexa488-Erbitux染色后的熒光圖像。


圖S4：A431和 KPL-4 細(xì)胞用Alexa488-Cyramza 和 Alexa488-PD-L1染色后的熒光圖像。
 

對制備的四種ICG-抗體共軛物的光學(xué)特性進(jìn)行進(jìn)一步的探索，作者發(fā)現(xiàn)ICG-Herceptin在1000納米以上的SWIR熒光強(qiáng)度比其在830納米的NIR熒光強(qiáng)度弱至少20倍。然而，ICG-Herceptin的SWIR熒光具有足夠的強(qiáng)度，可以通過使用InGaAs CCD相機(jī)進(jìn)行探測。ICG-Herceptin共軛物在水中的SWIR熒光量子產(chǎn)率約為0.5%。圖3b顯示了含有ICG-Herceptin水溶液(2 μM)的毛細(xì)管的SWIR熒光圖像。這些圖像是用波段濾光片(1000±15納米，1100±15 nm和1300±15納米)，其中ICG的激發(fā)波長被設(shè)定為785納米。盡管ICG-Herceptin的SWIR熒光強(qiáng)度隨著檢測波長的增加而降低，但其SWIR熒光可在1000-1300nm的波長范圍內(nèi)被檢測到。為了檢查SWIR區(qū)域的光散射，我們檢測了通過瓊脂糖凝膠的SWIR熒光。圖3c顯示了ICG–Herceptin (2μM)的NIR和SWIR熒光發(fā)射的比較。這些圖像是用含有ICG-Herceptin水溶液的毛細(xì)管(直徑0.5毫米) 拍攝的，其熒光穿過包含脂肪乳劑的1%瓊脂糖凝膠(厚度:0、1和2毫米)。由于散射，ICG-Herceptin的近紅外熒光圖像隨著瓊脂糖凝膠厚度的增加而模糊，相比之下，ICG-Herceptin的SWIR 熒光圖像不那么分散，因此與在NIR區(qū)域拍攝的熒光圖像相比，熒光圖像更清晰。SWIR熒光圖像的半峰全寬比NIR熒光圖像的小三倍(圖3c中的下圖)。與凝膠中的NIR熒光相比，SWIR熒光的散射更低，因此圖像更清晰。盡管ICG的SWIR熒光與其NIR熒光相比非常弱，但由于SWIR區(qū)域的組織散射和自熒光較低，SWIR熒光圖像的信號與背景對比度較高(圖3c)。

圖3: (a)ICG-Herceptin的激發(fā)和發(fā)射光譜。(b)充滿ICG-Herceptin的毛細(xì)管的SWIR熒光圖像。(c)填充有ICG-赫賽汀的毛細(xì)管的近紅外熒光(830納米)和SWIR熒光(> 1000納米)圖像，熒光穿過含有1%脂肪乳的瓊脂糖凝膠(厚度:0、1和2毫米)。下方圖片顯示了穿過2 mm厚度的瓊脂糖凝膠的SWIR圖像的強(qiáng)度分布。
 

然后，作者在小鼠中使用ICG-抗體共軛物進(jìn)行了近紅外和SWIR腫瘤成像，發(fā)現(xiàn)SWIR腫瘤成像中的信號與背景對比度比近紅外腫瘤成像好1.5-2倍。通過將人乳腺腫瘤細(xì)胞(KPL-4)31植入裸鼠來制備乳腺腫瘤承載小鼠。腫瘤的直徑約為5毫米(圖4a)。在向攜帶乳腺腫瘤的裸鼠的尾靜脈注射ICG-Herceptin后的第0、1和3天拍攝NIR和SWIR熒光圖像(圖4b)。注射ICG-Herceptin后，立即從肝臟觀察到ICG的強(qiáng)熒光信號，而從乳腺腫瘤僅檢測到弱熒光信號。注射ICG-Herceptin一天后，清晰地觀察到乳腺腫瘤的NIR和SWIR熒光。注射后三天，大部分ICG-Herceptin積聚到乳腺腫瘤，導(dǎo)致腫瘤產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光效應(yīng)。為了研究ICG-Herceptin在乳腺腫瘤中的主動(dòng)積累，進(jìn)行了一項(xiàng)使用ICG-正常IgG的對照實(shí)驗(yàn)。在這種情況下，與注射ICG-Herceptin的小鼠相比，沒有從乳腺腫瘤中觀察到明顯的SWIR熒光 (圖4b中的右圖)。注射后三天腫瘤的NIR和SWIR熒光圖像的比較顯示，SWIR腫瘤圖像的信號對背景(S/B)對比度比NIR腫瘤圖像高1.5倍(圖4c)。SWIR 熒光圖像中的低背景信號(圖4b)是由SWIR區(qū)域中的低組織自熒光引起的，此外，我們檢查了被其他類型的分子成像探針染色的乳腺腫瘤的圖像對比度的差異，ICG-Erbitux、ICG-Cyramza和ICG-抗PD-L1偶聯(lián)物(圖4d)。在所有情況下，SWIR熒光圖像的信噪比比NIR熒光圖像高1.8-2.0倍。

圖4:  (a)帶有乳腺腫瘤的裸鼠的明場圖像。紅色圓圈表示乳腺腫瘤的位置。(b)尾靜脈注射ICG-Herceptin后裸鼠的近紅外(830納米)和SWIR (>1000納米)熒光圖像。右圖顯示了小鼠乳腺腫瘤的離體SWIR熒光圖像，其中小鼠靜脈注射ICG-Herceptin和ICG-正常IgG。ICG-正常的IgG被用作陰性對照。(c)乳腺腫瘤的SWIR和近紅外熒光圖像的信噪比。(d)注射ICG-Erbitux、ICG-Cyramza和ICG-PDL1抗體三天后拍攝的乳腺腫瘤的近紅外和SWIR熒光圖像。
 

為了評估SWIR熒光對腫瘤的檢測靈敏度，我們對不同大小的乳腺腫瘤(直徑約2毫米至8毫米)進(jìn)行了SWIR熒光成像。注射ICG-Herceptin三天后，拍攝乳腺腫瘤SWIR熒光圖像(圖5a)。接下來，我們評估了檢測腫瘤特異性膜蛋白表達(dá)水平的檢測靈敏度。對帶有大小相似的皮膚和乳腺腫瘤的裸鼠進(jìn)行SWIR熒光成像。如圖5b所示，使用ICG-Herceptin的SWIR熒光成像顯示，乳腺腫瘤的熒光強(qiáng)度比皮膚腫瘤高約3倍(圖5b中的左圖)。這一結(jié)果表明，與皮膚腫瘤相比，HER2在乳腺腫瘤中的表達(dá)更高。使用ICG-Erbitux的SWIR熒光成像顯示EGFR的表達(dá)水平在兩種不同的腫瘤中是相似的(即圖5b中的右圖像)。這些觀察結(jié)果與A431和KPL-4細(xì)胞的蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果一致(圖2a)。因此，使用ICG-抗體共軛物的SWIR熒光成像對于檢測腫瘤中膜蛋白的不同表達(dá)水平具有高靈敏度。

圖5:  (a)不同大小的乳腺腫瘤(直徑2毫米至8毫米)的明場和SWIR熒光(> 1000納米)圖像。紅色的虛線圓圈表示乳腺腫瘤的位置。(b)帶有乳腺腫瘤(KPL-4)和皮膚腫瘤(A431)的裸鼠的明場和SWIR熒光圖像。
 

接著，為了對腫瘤血管生成進(jìn)行雙色SWIR熒光成像，作者使用了兩種類型的SWIR熒光探針：ICG-Herceptin和PbS量子點(diǎn)(QDs)。首先，將ICG-Herceptin靜脈注射到患有乳腺腫瘤的小鼠體內(nèi)。三天后將ICG-Herceptin注射液、谷胱甘肽包埋的水分散性PbS QDs靜脈注射給荷瘤小鼠。注射PbS量子點(diǎn)后，立即進(jìn)行雙色SWIR熒光成像。通過使用ICG (ex:785nm)和PbS QDs (ex:975 nm)的SWIR雙色熒光，腫瘤和新生血管分別在SWIR區(qū)域可視化(圖6)。應(yīng)該注意的是，小腫瘤(直徑約4mm))中的新生血管存在于腫瘤的外圍(圖6a)，而大腫瘤(直徑約10毫米)的新生血管存在于腫瘤的外圍和內(nèi)部(圖6b)。這些結(jié)果表明雙色SWIR熒光成像能夠光學(xué)檢測腫瘤以及腫瘤血管生成。

圖6: 裸鼠乳腺腫瘤和新血管的雙色SWIR熒光圖像。腫瘤直徑約為4毫米(a)和10毫米(b)。乳腺腫瘤用ICG-Herceptin染色。來自腫瘤的SWIR熒光(青色)通過785納米的激發(fā)在1000納米以上的波長被檢測到。通過小鼠尾靜脈注射谷胱甘肽包埋的PbS量子點(diǎn)來觀察新血管。新血管的SWIR熒光(紅色)是通過975納米激發(fā)在1300±15納米檢測到的。
 

最后，作者發(fā)現(xiàn)使用ICG-抗體共軛物的SWIR熒光成像有可能應(yīng)用于人類癌癥腫瘤的光學(xué)診斷。圖7展示了使用抗癌藥物(Kadcyla)（恩美曲妥珠單抗）治療乳腺腫瘤(KPL-4)腫瘤縮小的時(shí)間歷程SWIR熒光成像。Kadcyla是一種用于HER2陽性癌癥治療的抗體-藥物共軛物，Kadcyla含有抗HER2抗體(Herceptin)， HER2陽性乳腺腫瘤用ICG- Herceptin (0.2毫克)染色。注射ICG- Herceptin兩天后，乳腺腫瘤的SWIR熒光清晰可見，腫瘤直徑約為5毫米(圖7)。在用Kadcyla (0.2 mg)治療的帶有乳腺腫瘤的小鼠中，腫瘤大小明顯減小(圖7a和S8 ):在注射Kadcyla的第9天后，腫瘤大小減小到直徑約2 mm。這一結(jié)果表明， Kadcyla治療可以誘導(dǎo)HER 2陽性乳腺腫瘤細(xì)胞凋亡。相比之下，在未經(jīng)Kadcyla治療的小鼠中，乳腺腫瘤的大小逐漸增大 (圖7b)。

圖7：用(a)和不用(b)Kadcyla(0.2毫克)治療的乳腺腫瘤的SWIR熒光(> 1000納米)圖像。在注射ICG-赫賽汀兩天后， Kadcyla被靜脈注射到患有乳腺腫瘤的小鼠體內(nèi)。這些圖像是在注射Kadcyla后0、3、6和9天拍攝的。在Kadcyla治療后，對9天的小鼠拍攝乳腺腫瘤的離體明場圖像。
 

參考文獻(xiàn)

Setsuko Tsuboia and Takashi Jin. Shortwave-infrared (SWIR) fluorescence molecular imaging using indocyanine green–antibody conjugates for the optical diagnostics of cancerous tumours[J]. The Royal Society of Chemistry,2020, 10, 28171–28179

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