與常規(guī)熒光納米顆粒相比，持續(xù)發(fā)光納米顆粒（PLNPs）可以有效地避免光散射和組織自發(fā)熒光干擾，以實現生物醫(yī)學成像增強的靈敏度和信噪比（SNR）。特別地，金屬離子摻雜的PLNPs具有許多優(yōu)點，例如良好的光穩(wěn)定性，窄發(fā)射帶和長的余輝壽命。作為一種重要的稀土離子，通常使用YB3 +來增強持續(xù)發(fā)光特性，但一些研究中的激發(fā)主要是UV或發(fā)光二極管光，其具有在實現由于組織穿透深度的限制而導致的深度成像的重復激活的限制。

與這些激發(fā)源相比，X射線在生物組織中具有幾乎無限的滲透深度，散射越弱和層析的簡化圖像重建，這被證明是一種有效的激勵能量源，以產生更好的空間分辨率的更深成像的發(fā)光。因此，通過簡單地調節(jié)稀土離子的價態(tài)來優(yōu)化它們的發(fā)光，以實現X射線激活的二合一的近紅外和短波紅外持久發(fā)光，以實現體內的可再生成像，是一種迫切的需求。

這里，作者通過簡單地調節(jié)稀土離子的價態(tài)，設計了介孔二氧化硅包覆的Yb摻雜鍺酸鎂納米顆粒(MMGO)，X射線照射后,它具有良好的二合一的近紅外(NIR)和短波紅外(SWIR)的持久發(fā)光，并且在腫瘤區(qū)域具有高的載荷量和可控的釋放輪廓。體外和體內的研究表明，重復激活MMGO，以實現用于跟蹤小鼠貨物輸送的可充電持續(xù)發(fā)光成像。此外，刺激的藥物釋放曲線有效抑制腫瘤生長。X射線激發(fā)的二合一近紅外和SWIR持久發(fā)光成像不僅可以對深部腫瘤進行可充電成像，而且可以實現長期跟蹤，具有顯著的抑瘤效果。

圖1：(A)MgGO的TEM圖像，比例尺：200 nm;(B)掃描透射電子顯微鏡−能量色散X射線能譜(EDS)的MgGO元素圖譜圖像，比例尺：50 nm;(C)MgGO的XEOL和XEPL譜;(D)X射線激發(fā)的MMGO的近紅外持久發(fā)光衰減圖像;(E)X射線激發(fā)的MMGO的SWIR持久發(fā)光衰減圖像;(F)用1.5 cm厚的豬肉切片在停止X射線照射后不同時間(0、5和10min)檢測到X射線激發(fā)的近紅外(NIR)持久發(fā)光;(G)用1.5 cm厚的豬肉切片在停止X射線照射后不同時間(0、5和10min)檢測到X射線激發(fā)的近紅外(NIR)體內持久發(fā)光。
 

一、合成和表征

Yb2+/Yb3+納米顆粒(MMGO)透射電子顯微鏡(TEM)圖像顯示，mMGO分散均勻，二氧化硅外殼為24.5±2.5 nm(圖1a)。X射線衍射(XRD)分析表明，MgO核為鈦鐵礦結構的MgGeO3，MgO在近紅外和SWIR X射線激發(fā)下同時發(fā)射出強烈的近紅外和短波紅外X射線的光學發(fā)光(XEOL)(圖1c)，證實了Yb2+和Yb3+在MgO中的共存和能量轉移。停止X射線照射后，仍然可以檢測到近紅外和SWIR的持久發(fā)光(圖1c)。為了驗證其潛在的持久發(fā)光應用，用X射線(25mGy)照射5 mg MgO，用IVIS系統和NIR-Optics SeriesIII900/1700系統采集不同時間點的X射線激發(fā)持久發(fā)光(XEPL)衰變圖像。近紅外和SWIR持久發(fā)光均可檢測到超過30分鐘(圖1D，e)。更重要的是，X射線照射可以反復激活這種持久發(fā)光(圖1D，e)。即使在X射線照射后很長一段時間內，信噪比也是相對較高的。近紅外持久發(fā)光信號強度隨X射線劑量的增加而增大，且呈現劑量依賴關系。通過記錄不同輻照時間后的持續(xù)發(fā)光衰減圖像，還發(fā)現X射線輻照的飽和時間為2min。

二、深部組織的X射線充電近紅外持久發(fā)光成像

為了顯示組織的深度穿透，在mMGO(5毫克)和X射線源之間放置了一塊1.5厘米的豬肉切片。停止X射線照射(25mGy)后，分別于照射后0、5、10min進行顯像。強的近紅外持久發(fā)光在照射點清晰地發(fā)射，并且即使在X射線照射三個周期之后也沒有衰減地重復刺激(圖1f)。這證實了MMGO具有很強的輻射穩(wěn)定性。為了證實X射線照射劑量(25mGy)的生物安全性，評估了X射線照射后HepG2細胞的存活率和小鼠皮膚的損傷。結果表明，細胞存活率無明顯下降，皮膚無明顯損傷，說明X射線照射劑量是生物安全的。在此基礎上，進一步在體內驗證了自由自發(fā)熒光的深度成像。

圖2:(A)DOX、MMGO和DOX-MMGO的吸收光譜;(B)不同pH值(7.4和5.6)的DOX-mMGO的DOX釋放行為;(C)不同時間點(1、4、8h)DOX-mGO孵育HepG2細胞后的共聚焦圖像;藍色和紅色分別代表Hoechst 33342和DOX熒光(比例尺：40μm);(D)不同濃度的mGO與HepG2細胞孵育24h后的存活率;(E)用不同濃度的DOX-mGO和DOX孵育HepG2細胞24小時后，觀察細胞存活率。
 

三、藥物裝載和釋放

介孔層具有較高的比表面積(175m2g−1)和中孔尺寸(3.3nm)，表明mMGO可用于貨物的包裹和輸送。將抗癌藥物DOX成功地包裹到mMGO(DOX-mMGO)中，載藥量為64.3%(圖2a)。包埋后的DOX-mGOS在PBS、Dulbecco‘s Modified Eagle’s培養(yǎng)基(DMEM)和胎牛血清(FBS)等不同介質中均表現出良好的膠體穩(wěn)定性。通過研究DOX-mGO在PBS緩沖液(pH 7.4和pH 5.6)中的釋放行為。從圖2B可以看出，在酸性條件下，DOX分子中的氨基發(fā)生質子化反應，增加了DOX的溶解度，從而促進了DOX從mMGO中的快速釋放。這些結果表明，低劑量的X射線可以有效地穿透深層組織，而傳統的光學激發(fā)在這方面面臨著巨大的挑戰(zhàn)，這種激活實現了高效和可充電的近紅外持久發(fā)光，用于在酸性腫瘤微環(huán)境中對深層組織進行超靈敏成像，追蹤DOX釋放。

四、體外實驗

接下來，使用HepG2人肝癌細胞系評估了DOX-mGO的細胞攝取和細胞內釋放行為(圖2c)。孵育4h后，由于DOX-mGO的內吞作用，細胞內出現微弱的DOX紅色熒光信號，且主要分布在胞漿中。隨著孵育時間的延長，8h胞漿和胞核出現明顯的紅色信號，說明DOX由胞內DOX-mGO逐漸釋放并進入胞核。在與MgGO孵育24小時后，即使高劑量的200μg m L−1，HepG2細胞的存活率也超過85%(圖2 d)。在加載DOX后，DOX-mMGOS顯示出與游離DOX相似的癌細胞殺傷作用(圖2e)，顯示了這種藥物加載策略的高效性。

圖3:(A)靜脈注射后血液中MgO水平的時間進程;半衰期(t1/2)為3.0±0.4h;(B)靜脈注射后不同時間點mMGO在主要器官和腫瘤中的生物分布;將mMGO濃度歸一化為每克器官注射鎂元素的百分比(%ID g−1);(C)靜脈注射mMGO后，體內X射線激發(fā)的近紅外持久發(fā)光成像;(D)瘤內注射MgGO后的體內X射線激發(fā)SWIR持久發(fā)光成像。
 

五、體內生物分布和生物安全性評價

 

此外，采用電感耦合等離子體質譜(ICP-MS)定量分析了DOX-mGO靜脈注射HepG2荷瘤小鼠后組織中鎂離子的含量，以評價DOX-mGO在體內的循環(huán)和生物分布。DOX-MGO的循環(huán)時間相對較長，半衰期為3.0h±0.4h(圖3a)，導致DOX-MGO在腫瘤中有效積聚，注射后8h每克組織的注射劑量(%ID g−1)為6.1%(圖3b)。血清化學和血液學分析表明，DOX-mGOS對肝功能、腎功能和血液指標無明顯影響，表明DOX-mGOS在體內具有良好的生物相容性。

 

六、在活體X射線充電的近紅外和SWIR持久發(fā)光成像

 

在確認了體內生物安全性后，進一步研究了mMGO的近紅外(NIR)和短波紅外(SWIR)體內持久發(fā)光成像。靜脈注射MGO(3.5mgkg-1)后，用低劑量X射線(25mGy)照射腫瘤區(qū)域，并在注射后不同時間點用IVIS系統立即進行顯像。皮下腫瘤內可見強信號，注射后8h信號最強(圖3c)。離體器官的近紅外持久發(fā)光成像顯示腫瘤對mMGO攝取一致。此外，作者還研究了體內X射線激發(fā)的SWIR持久發(fā)光成像。在瘤內注射MgO(20 mg kg-1)并隨后進行X射線照射后，即使在停止X射線照射后，仍可在高信噪比的腫瘤中檢測到較強的SWIR發(fā)光信號(圖3D)。此外，還評估了肌肉注射近紅外持久發(fā)光成像的信噪比。

圖4:(A)PBS、mMGO、DOX和DOX-mGO不同治療后14天內的腫瘤體積曲線;誤差條基于平均值±標準差(n=5);(B)治療0、6和14天后不同組小鼠的代表性照片;(C)14天后切除腫瘤的典型照片;(D)腫瘤組織14天內進行HE染色(比例尺：100μm);(E)PBS、mMGO、DOX和DOX-mMGO不同處理后14天的體重增長曲線;(E)14天后腫瘤切片HE染色(比例尺：100μm)。
 

七、在活體化療中

 

在證明了持續(xù)發(fā)光成像在體內具有良好的示蹤能力后，在體內用HepG2荷瘤小鼠評估了其抗癌效果。如圖4a所示，PBS和mMGOS組的腫瘤生長迅速，而作為對比，游離DOX和DOXmMGOS組抑制了腫瘤的生長。此外，DOX-mMGOS組的抑瘤率高達75.0%(與PBS組相比)，遠高于游離DOX組(35.4%)。小鼠和分離腫瘤的典型照片顯示出與腫瘤生長曲線一致的結果(圖4b，c)。這些結果表明，更多的DOX分子被有效地運送到腫瘤中，并從DOX-mMGO中迅速釋放。蘇木精伊紅(H&E)染色顯示DOXmMGOS組腫瘤組織結構損傷更明顯，提示其對HepG2的抑瘤作用更強(圖4d)。此外，在所有治療組的終點沒有明顯的體重下降(圖4e)；然而，注射后游離DOX的體重略有下降，表明游離DOX的副作用更大。

 

總體而言，所制備的mMGO將是一種很有前途的二合一持久發(fā)光和可充電顯像劑，用于追蹤深層組織中的藥物釋放。

 

參考文獻

Ding D, Li S, Xu H, Zhu L, Meng S, Liu J, Lin Q, Leung SW, Sun W, Li Y, Chen H. X-ray-Activated Simultaneous Near-Infrared and Short-Wave Infrared Persistent Luminescence Imaging for Long-Term Tracking of Drug Delivery. ACS Appl Mater Interfaces. 2021 Apr 14;13(14):16166-16172. doi: 10.1021/acsami.1c02372. Epub 2021 Apr 2. PMID: 33797886.
 

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