人類遐想通過冷凍保存，實現(xiàn)在未來復(fù)活。在科幻小說《三體》中，描述了人類可以在冬眠中度過幾個世紀(jì)，醒來之時依然保持著冬眠時的生命體征和生理年齡。漫威電影里的美國隊長冰封70年后再次蘇醒，拯救世界。

看似神秘的冷凍保存技術(shù)，對于做細(xì)胞培養(yǎng)的小伙伴而言是一點也不陌生，細(xì)胞凍存可是人人不能免考的必修課呀。

01  細(xì)胞凍存的原理
細(xì)胞凍存是細(xì)胞保存的主要方法之一，也是保持細(xì)胞活性和增殖能力的重要手段。細(xì)胞可以通過被暫時休眠（凍存），仿佛童話里的睡美人，留住年輕芳華，等到需要時再被輕輕喚醒（復(fù)蘇）。

低溫下，活細(xì)胞中的生物和化學(xué)反應(yīng)都會大大降低，為細(xì)胞長期凍存提供了可能。冷凍對大多數(shù)活生物體都是致命的，細(xì)胞凍存是利用冷凍保護(hù)劑來降低冰點，緩慢凍結(jié)細(xì)胞的過程中，細(xì)胞內(nèi)水分透出細(xì)胞，使細(xì)胞凍結(jié)中冰晶形成減少，從而避免了由于冰晶形成對細(xì)胞中生命活性物質(zhì)的一系列損傷。【1】細(xì)胞凍存時利用低溫降低細(xì)胞代謝，使細(xì)胞處于停止生長的“休眠”狀態(tài)，等需要使用的時候再進(jìn)行復(fù)蘇操作。

細(xì)胞儲存在-70℃冰箱中，可以保存一年；若儲存在-196℃的液氮環(huán)境中，理論上可以實現(xiàn)長期永存。

02  細(xì)胞凍存的常見方法
細(xì)胞凍存和復(fù)蘇的關(guān)鍵要點是慢凍快融。細(xì)胞凍存的效果主要與降溫步驟、凍存保護(hù)液的使用、凍存溫度、復(fù)溫速率及用于凍存的細(xì)胞生長狀態(tài)有關(guān)。【2】降溫速率過快容易引起細(xì)胞內(nèi)冰晶損傷，所以為防止細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰必須采用一個“慢”的降溫過程，并使用凍存保護(hù)劑，即凍存液。目前細(xì)胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜（DMSO）作保護(hù)劑。

根據(jù)降溫速度區(qū)分，細(xì)胞凍存可以分為程序降溫凍存與非程序降溫凍存。傳統(tǒng)的凍存方法是將冷凍管置于4℃ 30分鐘、-20℃ 30分鐘、-80℃過夜再轉(zhuǎn)液氮。這種凍存方法步驟多，而且需要遵守幾個時間點，容易被遺忘，對于繁忙的實驗人員而言不那么友好。而程序降溫方法，采用降溫速率-1℃～-2℃/min；當(dāng)溫度達(dá)-25℃以下時，可增至-5℃～-10℃/min，再放至-196℃液氮保存。常規(guī)的程序降溫凍存方法較為復(fù)雜、費時，需要儀器設(shè)備花費較高，所以非程序降溫凍存方法便應(yīng)運而生，它能大大簡化凍存流程，細(xì)胞可直接置于-80°C冰箱完成凍存過程，更為簡便高效。

03  細(xì)胞凍存和復(fù)蘇的最佳時間
細(xì)胞在體外生長期間，通常分為三個階段：潛伏期、指數(shù)生長期和平臺期。潛伏期通常是細(xì)胞剛剛傳代，此時細(xì)胞開始貼附基質(zhì)和伸展骨架，代謝活動集中在粘附蛋白和骨架蛋白的表達(dá)，細(xì)胞數(shù)量在這段時間內(nèi)幾乎沒有增加。

隨后，細(xì)胞開始指數(shù)生長期，轉(zhuǎn)錄翻譯過程旺盛，胞內(nèi)物質(zhì)、信號傳遞迅速，細(xì)胞數(shù)量迅速增長。如果在這個時期凍存，實際上是強行將細(xì)胞凍結(jié)在代謝的某一時刻，勢必造成對解旋的DNA、轉(zhuǎn)錄翻譯中的RNA和蛋白的機(jī)械損傷，增加個別環(huán)節(jié)發(fā)生錯誤的風(fēng)險。

隨著細(xì)胞數(shù)量的增長，培養(yǎng)容器內(nèi)，細(xì)胞匯合達(dá)到90%以上。大部分細(xì)胞因為“接觸抑制”而停止高速代謝和增殖，胞內(nèi)活動趨于平緩。所以，建議在剛剛進(jìn)入平臺期時凍存細(xì)胞，既可以獲得足量的細(xì)胞，也不會對細(xì)胞造成過多的機(jī)械損傷。

參考文獻(xiàn)：
1.吳敬智，繆著，馬波，劉馨.影響懸浮細(xì)胞冷凍保存的因素分析[J].中國生物醫(yī)學(xué)技術(shù)，2020,10（15）：512-517.

2.陳凱，李欣然，宣言. SD 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在-80 ℃低溫條件下的凍存[J].中國組織工程研究，2016，20(10):1433-1438.