研究重點(diǎn)解析：

1. 在慢性HF患者中，植入LVAD后心肌恢復(fù)且MPC表達(dá)增加

2. MPC缺失足以誘導(dǎo)心肌肥大和HF

3. MPC過表達(dá)則減弱藥物誘導(dǎo)的肥大

4. 線粒體丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)失衡是誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的充分必要條件

5. 抑制MCT4可以減輕細(xì)胞和小鼠的心肌肥大
 

心力衰竭（heart failure，HF）是一種復(fù)雜的慢性心臟病，其特征是心臟的泵血或血液再灌注能力降低，已成為全球死亡的主要原因。HF的發(fā)生通常以病理性心肌肥大為先導(dǎo)征兆。晚期HF患者的治療主要是侵入性手術(shù)，例如心臟移植和左心室輔助裝置（LVAD）植入，以此通過機(jī)械支持恢復(fù)足夠的血流量和血液動(dòng)力學(xué)。然而植入LVAD后一部分患者有效而另一部分患者卻效果不佳，其原因尚不清楚。來自美國(guó)猶他大學(xué)Stavros G. Drakos和Jared Rutter團(tuán)隊(duì)利用RNA測(cè)序、葡萄糖示蹤及代謝組學(xué)等技術(shù)發(fā)現(xiàn)，在慢性HF患者中，植入LVAD后心肌恢復(fù)伴隨著MPC（線粒體丙酮酸載體）表達(dá)增加，同時(shí)揭示了丙酮酸-乳酸軸的改變是心臟肥大和心力衰竭的早期特征，抑制MCT4可以改善HF，相關(guān)研究成果發(fā)表于《Cell Metabolism》。

線粒體丙酮酸載體(MPC)是MPC1和MPC2的異二聚體復(fù)合體，它將糖酵解的產(chǎn)物丙酮酸運(yùn)輸?shù)骄�粒體，在線粒體中通過丙酮酸脫氫酶(PDH)和三羧酸（TCA）循環(huán)完全氧化。MPC亞基在正常成人心臟中高表達(dá)，可能是決定丙酮酸氧化或胞質(zhì)轉(zhuǎn)化為乳酸的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。
 

一. MPC1缺失促進(jìn)心肌肥大導(dǎo)致HF

晚期慢性心力衰竭患者植入LVAD后，患者被分為有應(yīng)答者和無(wú)應(yīng)答者（應(yīng)答者組定義為L(zhǎng)VEF增加大于50%，LVEDD 小于6.0 cm，無(wú)響應(yīng)組定義為L(zhǎng)VEF增加小于50%，無(wú)論LVEDD是否改變）。植入LVAD后，與無(wú)應(yīng)答者不同，有應(yīng)答組的心肌收縮功能指標(biāo)（LVEF）顯著增加，而心臟大小指標(biāo)（LVEDD）顯著減少。收集并分析兩組HF患者在植入LVAD前和植入LVAD后的左心室組織，以明確應(yīng)答者心力衰竭恢復(fù)的機(jī)制。MPC1豐度檢測(cè)結(jié)果顯示，與供體對(duì)照組相比，在植入LVAD前，應(yīng)答組和非應(yīng)答組的心肌組織中MPC1均降低；而植入LVAD后，心肌組織中MPC1在應(yīng)答組中增加，但在無(wú)應(yīng)答組的MPC1豐度不變。檢測(cè)丙酮酸脫氫酶(PDH)的磷酸化程度（PDH被磷酸化后失活，去磷酸化后激活），結(jié)果顯示，在應(yīng)答組中，與供體對(duì)照組相比，在植入LVAD 前顯著升高，在植入LVAD 后降低并接近對(duì)照水平；而在無(wú)應(yīng)答組植入LVAD前和后，與供體對(duì)照組相比，PDH磷酸化程度均增加，導(dǎo)致PDH失活，提示丙酮酸氧化受到抑制，可能存在一種潛在的代謝病因，以線粒體丙酮酸代謝缺陷為中心導(dǎo)致心衰。
 

由于MPC在HF患者中較低，而在應(yīng)答者植入LVAD后增加，那么MPC表達(dá)的改變是否對(duì)HF和康復(fù)有因果關(guān)系？為了確定MPC缺失是否足以在體內(nèi)誘導(dǎo)HF，構(gòu)建心臟特異性和他莫昔芬誘導(dǎo)的MPC1敲除小鼠(MPC1CKO)，MPC1敲除小鼠表現(xiàn)為心臟特異性和他莫昔芬誘導(dǎo)的MPC1和MPC2蛋白的缺失。在他莫昔芬治療1周后，對(duì)這些小鼠進(jìn)行連續(xù)的超聲心動(dòng)圖檢查，結(jié)果顯示，注射他莫昔芬1周后MPC1敲除小鼠與野生型(WT)幼崽無(wú)區(qū)別；而在誘導(dǎo)9周后(9 wpi)， MPC1敲除小鼠表現(xiàn)出擴(kuò)張性心肌病，到16 wpi時(shí)進(jìn)展為明顯的心衰。組織切片結(jié)果表明，與WT小鼠相比，MPC1敲除小鼠的心臟橫斷面積增加。從13wpi開始左室重量增加，也提示MPC1敲除小鼠的心肌肥大。在13 wpi后，MPC1敲除小鼠體重顯著下降，之后開始死亡，并在18 wpi時(shí)全部死亡。綜上所述，小鼠中MPC1缺失足以引起心肌肥大和心衰（圖1）。

圖1. MPC1缺乏足以促進(jìn)心肌肥大并導(dǎo)致心力衰竭
 

二. MPC缺失導(dǎo)致早期肥大和最終線粒體衰竭

將8 wpi(肥大前)和16 wpi(心衰后)的對(duì)照組和MPC1敲除小鼠的心臟組織進(jìn)行RNA測(cè)序，并對(duì)差異上調(diào)基因進(jìn)行GO分析，結(jié)果顯示，與WT小鼠相比，MPC1敲除小鼠中參與心肌細(xì)胞發(fā)育、膠原組織、細(xì)胞分裂和損傷反應(yīng)的基因表達(dá)均上調(diào)，在8周上調(diào)明顯，并在16周進(jìn)一步加強(qiáng)，提示肥大前基因調(diào)控程序的啟動(dòng)。當(dāng)檢查單個(gè)基因時(shí)，與WT小鼠相比，MPC1敲除小鼠中與心肌肥大和糖酵解相關(guān)的基因表達(dá)顯著升高，與TCA循環(huán)酶相關(guān)基因表達(dá)降低；還發(fā)現(xiàn)，在8 wpi和16 wpi時(shí)，丙酮酸代謝相關(guān)基因調(diào)控失調(diào)。MPC1敲除小鼠的左室組織透鏡(TEM)結(jié)果顯示，在8 wpi時(shí)，線粒體結(jié)構(gòu)正常；而在16 wpi時(shí)，線粒體嵴不規(guī)則，染色強(qiáng)度較高。綜上所述，雖然MPC的缺失引起了代謝基因表達(dá)的早期代償性變化，但最終還是導(dǎo)致線粒體功能紊亂，發(fā)生HF和死亡（圖2）。

圖2. MPC丟失是一種心衰的早期損傷
 

三. 線粒體丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)失衡是誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的必要條件

如果MPC活性的喪失是心肌細(xì)胞肥大的早期損傷誘因，那么MPC的過表達(dá)可能會(huì)導(dǎo)致對(duì)誘導(dǎo)肥大藥物的抵抗。用MPC過表達(dá)載體(MPC OE)或空白載體(EV)轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞（它可以分化成具有許多心肌細(xì)胞特征的細(xì)胞），同時(shí)使用肥大誘導(dǎo)藥物苯腎上腺素(PE)、異丙腎上腺素(ISO)和血管緊張素(ATII)以及MPC抑制劑UK-5099 (UK)處理MPC OE和EV細(xì)胞，結(jié)果顯示，MPC OE可以減輕所有四種藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞肥大。由于MPC是一種蛋白質(zhì)復(fù)合物，它將胞質(zhì)丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體基質(zhì)中，并沒有內(nèi)在的酶活性。因此，切斷這種聯(lián)系就足以促進(jìn)肥大。為了證實(shí)這一點(diǎn)，使用葡萄糖示蹤技術(shù)分析上述相同實(shí)驗(yàn)條件下碳水化合物代謝通量的變化，結(jié)果顯示，在UK、MPC1 KD（敲低，基因干擾）和PE處理的H9c2細(xì)胞中，細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外同位素標(biāo)記的乳酸均增加，而同位素標(biāo)記的檸檬酸在TCA循環(huán)中下降。這些代謝擾動(dòng)不只在MPC抑制或敲低后發(fā)生，也在PE處理后發(fā)生。且MPC OE處理后，則逆轉(zhuǎn)了 PE 誘導(dǎo)的 TCA 循環(huán)中間體的降低，同時(shí)防止了細(xì)胞肥大，這進(jìn)一步支持了這種代謝轉(zhuǎn)移對(duì)細(xì)胞肥大的必要性（圖3）。

圖3. 線粒體丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)的喪失是誘導(dǎo)培養(yǎng)心肌細(xì)胞肥大的必要條件
 

四. 線粒體丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)失衡是誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的充分條件

為了更好地了解代謝通量變化、肥大和 HF 之間的關(guān)系，從MPC1敲除小鼠中分離培養(yǎng) ACMs（成年小鼠心肌細(xì)胞）。在心肌結(jié)構(gòu)或功能顯著異常前(12 wpi)和心衰發(fā)作后(16 wpi)分別分離心肌細(xì)胞，并進(jìn)行葡萄糖示蹤實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，與MPC活性喪失一致，在12 wpi時(shí)，MPC1敲除的ACMs細(xì)胞中，標(biāo)記的乳酸增加，檸檬酸減少，而TCA循環(huán)中間體富馬酸和琥珀酸的標(biāo)記不受影響。同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)標(biāo)記的丙氨酸水平正常，它的胞質(zhì)生成和線粒體輸入可以作為MPC獨(dú)立的替代機(jī)制，通過這種機(jī)制，糖酵解的碳得以供給TCA循環(huán)。而在16 wpi時(shí)，進(jìn)入TCA循環(huán)的標(biāo)記消失，丙氨酸標(biāo)記減少，乳酸輸出進(jìn)一步增加。這表明，線粒體丙酮酸攝取的減少足以在體外引起心肌細(xì)胞肥大，線粒體丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)失衡是誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的充分條件（圖4）。

圖4. MPC1CKO小鼠肥大和HF前糖酵解通量的動(dòng)態(tài)變化
 

五. 抑制MCT4可預(yù)防和逆轉(zhuǎn)心肌細(xì)胞肥大

已有文獻(xiàn)報(bào)道單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(MCT)家族的成員MCT4在肥大和HF中高表達(dá)，從而將乳酸從細(xì)胞中排出。作者開發(fā)一種MCT4抑制劑VB124，它可以特異性地抑制乳酸流出，從而將糖酵解碳通量轉(zhuǎn)向線粒體丙酮酸氧化。假設(shè)抑制MCT4阻斷了肥大心肌細(xì)胞的乳酸外流，導(dǎo)致糖酵解碳通量轉(zhuǎn)向線粒體丙酮酸氧化，進(jìn)而逆轉(zhuǎn)心肌肥大。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，將PE和VB124同時(shí)作用于H9c2細(xì)胞48h，結(jié)果表明，抑制MCT4可以阻止PE誘導(dǎo)的細(xì)胞肥大。為了確定MCT4抑制是否不僅能阻止PE誘導(dǎo)的細(xì)胞肥大，而且還能逆轉(zhuǎn)肥大，我們用PE預(yù)處理H9c2細(xì)胞48小時(shí)，然后再聯(lián)合PE和VB124處理48小時(shí)，結(jié)果表明，MCT4抑制完全逆轉(zhuǎn)了這些細(xì)胞的肥大表型。用PE和ISO處理ACMs，同樣發(fā)現(xiàn)VB124阻止了ACMs細(xì)胞的肥大表型。抑制MCT4后的逆轉(zhuǎn)效應(yīng)，以及MPC過表達(dá)的抗肥大效應(yīng)，均體現(xiàn)了心肌細(xì)胞線粒體丙酮酸代謝的重要性，這與植入LVAD的患者中觀察到的MPC豐度增加一致。葡萄糖示蹤實(shí)驗(yàn)也表明，VB124 可防止在 H9c2 和 ACM 細(xì)胞中用 PE 或 ISO 處理引起的代謝異常，VB124 降低了向乳酸的葡萄糖通量，并增加了進(jìn)入檸檬酸鹽和 TCA 循環(huán)的葡萄糖通量。在經(jīng)PE預(yù)處理、隨后經(jīng)VB124處理的細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了TCA循環(huán)通量的增加。綜上所述，抑制MCT4可以逆轉(zhuǎn)藥物誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大（圖5）。

圖5. 抑制MCT4可預(yù)防和逆轉(zhuǎn)心肌細(xì)胞肥大
 

六. 維持線粒體丙酮酸可防止心肌細(xì)胞肥大

構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)線粒體特異性標(biāo)簽(Mito-tag)的H9c2細(xì)胞，該標(biāo)簽?zāi)軌蚩焖俜蛛x和提取線粒體，這是量化線粒體內(nèi)代謝物改變的必要條件。檢測(cè)到心肌肥大藥物刺激導(dǎo)致穩(wěn)態(tài)丙酮酸水平下降，而MCT4抑制又恢復(fù)了穩(wěn)態(tài)丙酮酸水平。然而，在線粒體中未檢測(cè)到乳酸，這與乳酸主要是一種細(xì)胞質(zhì)代謝物的觀點(diǎn)一致。線粒體丙酮酸含量的這種模式與全細(xì)胞提取物中趨勢(shì)相反，在全細(xì)胞提取物中，UK、PE和ISO刺激導(dǎo)致丙酮酸和乳酸的增加，而MCT4抑制則逆轉(zhuǎn)了這種情況。為了確定這種丙酮酸可能是糖酵解的來源，我們將Mito-tag標(biāo)簽方法與葡萄糖示蹤組合，并觀察到丙酮酸同位素在未處理的細(xì)胞中呈現(xiàn)高豐度，而在UK、PE和ISO處理中未檢測(cè)到，且在MCT4抑制時(shí)再次出現(xiàn)。與之前的實(shí)驗(yàn)一致，任何情況下均未檢測(cè)到標(biāo)記的乳酸，這表明糖酵解產(chǎn)生的丙酮酸而非乳酸進(jìn)入線粒體并為這些細(xì)胞的TCA循環(huán)提供燃料。同時(shí)對(duì)這些Mito-tag細(xì)胞進(jìn)行不同時(shí)間梯度的葡萄糖示蹤實(shí)驗(yàn)，再次觀察到VB124處理后糖酵解進(jìn)入TCA循環(huán)的通量增加。除了丙酮酸-乳酸軸的變化，還觀察到在PE、ISO和UK處理的細(xì)胞中，線粒體中穩(wěn)態(tài)谷氨酸增加，天冬氨酸減少，且MCT4抑制后，線粒體天冬氨酸和谷氨酸水平則完全逆轉(zhuǎn)。同時(shí)也在全細(xì)胞裂解物中獲得相反趨勢(shì)，進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了心肌細(xì)胞中分室化線粒體代謝的重要性。 
 

糖酵解通量增加和細(xì)胞呼吸下降是心肌細(xì)胞肥大的常見現(xiàn)象。線粒體膜電位是ATP產(chǎn)生和蛋白質(zhì)輸入所必需的，是線粒體整體健康的可靠標(biāo)志。與此一致， ISO處理后，成年心肌細(xì)胞線粒體膜電位下降，而VB124處理完全逆轉(zhuǎn)了成年心肌細(xì)胞的膜電位。而且這些細(xì)胞在ISO處理后活性氧(ROS)升高，而VB124處理后發(fā)生逆轉(zhuǎn)。綜上所述，MCT4抑制可減輕和逆轉(zhuǎn)心肌細(xì)胞肥大，使線粒體氧化代謝正�；�（圖6）。

圖6. MCT4抑制補(bǔ)充線粒體丙酮酸通量，提高線粒體膜電位，減輕細(xì)胞溶質(zhì)ROS
 

七. 抑制MCT4可減輕ISO誘導(dǎo)的小鼠心肌肥大

考慮到抑制MCT4逆轉(zhuǎn)了PE、ISO和UK體外治療后的心肌細(xì)胞肥大，于是在心肌肥大的小鼠模型上再次驗(yàn)證。通過外科手術(shù)將小鼠植入滲透微型泵，連續(xù)輸送Veh或ISO以誘導(dǎo)小鼠肥大，同時(shí)通過每日小鼠灌胃VB124或Veh，持續(xù)4周。在4周結(jié)束時(shí)對(duì)這些小鼠進(jìn)行了超聲心動(dòng)圖檢查，并在死后收集心臟樣本。與細(xì)胞結(jié)果一致，注射ISO引起心臟體重比和LVEDD顯著增加，抑制MCT4時(shí)，則發(fā)生逆轉(zhuǎn)。
 

從ISO 和 VB124 處理的小鼠中分離出的整個(gè)心臟樣本進(jìn)行代謝組學(xué)檢測(cè)，層次聚類結(jié)果顯示了ISO 處理導(dǎo)致的代謝變化，而 VB124 處理則逆轉(zhuǎn)了這些變化，且主成分（PCA）分析結(jié)果顯示，抑制MCT4足以使經(jīng)過ISO處理的小鼠心臟的代謝譜恢復(fù)到與未經(jīng)處理的對(duì)照組同等的水平。在ISO誘導(dǎo)的肥大中，糖酵解中間體增加，再用VB124處理后，則恢復(fù)到對(duì)照水平。心肌左室組織透鏡分析顯示，ISO處理導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)畸變，而VB124處理改善了線粒體結(jié)構(gòu)畸變，而VB124處理后則恢復(fù)。綜上所述，抑制MCT4逆轉(zhuǎn)了ISO誘導(dǎo)的心肌肥大的多種病理特征，包括代謝紊亂和線粒體結(jié)構(gòu)損傷（圖7）。

圖7. MCT4抑制可防止小鼠心肌肥大
 

小結(jié)：

本研究發(fā)現(xiàn)，在植入LVAD的慢性心衰患者中，心臟恢復(fù)與心臟組織中MPC豐度的增加相關(guān)。相反，成年小鼠MPC基因缺失足以誘發(fā)心肌肥大、慢性心衰和死亡。此外，在多個(gè)體外心肌細(xì)胞模型中，MPC缺失足以誘導(dǎo)心肌肥大，而MPC過表達(dá)可減輕藥物誘導(dǎo)的心肌肥大。研究還發(fā)現(xiàn)乳酸輸出劑MCT4的活性在代謝上抑制MPC，是心肌肥大所必需的。本研究還開發(fā)了一種新型、有效的MCT4抑制劑，可以預(yù)防和逆轉(zhuǎn)細(xì)胞和小鼠的心肌肥大。通過葡萄糖示蹤實(shí)驗(yàn)和代謝組學(xué)的結(jié)合，我們發(fā)現(xiàn)線粒體丙酮酸氧化減少與心肌細(xì)胞肥大緊密相關(guān)�？傊�，本研究揭示了丙酮酸-乳酸代謝軸是心肌細(xì)胞生長(zhǎng)和功能的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)控節(jié)點(diǎn)，為心肌肥大疾病的有效治療和開發(fā)高效的MCT4抑制劑提供新策略。
 

繪譜幫你測(cè)：

通過葡萄糖示蹤實(shí)驗(yàn)和代謝組學(xué)的結(jié)合，上述研究發(fā)現(xiàn)線粒體代謝改變與心肌細(xì)胞肥大表型緊密相關(guān)。質(zhì)譜代謝組學(xué)可對(duì)生物樣品中的數(shù)千個(gè)小分子進(jìn)行全面、系統(tǒng)的分析，可以靈敏捕捉到機(jī)體代謝的細(xì)微變化，是尋找線粒體相關(guān)疾病的理想生物標(biāo)志物或藥物靶標(biāo)的最新技術(shù)。代謝組學(xué)可用于分析線粒體功能障礙的眾多上下游效應(yīng)，包括能量代謝、氧化應(yīng)激、NAD/NADH氧化還原失衡和能量缺乏在機(jī)體系統(tǒng)中的變化。文中涉及的線粒體代謝及其所有相關(guān)小分子代謝物檢測(cè)，麥特繪譜均可提供全套解決方案！歡迎掃碼聯(lián)系我們?nèi)〉迷敿?xì)資料。
 

參考文獻(xiàn)：

The pyruvate-lactate axis modulates cardiac hypertrophy and heart failure. Cell Metabolism. 2020. https://doi.org/10.1016/j.cmet.2020.12.003
 

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