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細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室中生物污染的來源、分類和消除方法

瀏覽次數(shù):5537 發(fā)布日期:2021-6-23  來源:本站 僅供參考,謝絕轉(zhuǎn)載,否則責(zé)任自負(fù)
摘要
污染是科學(xué)家在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室工作中最擔(dān)心的情況之一。細(xì)胞培養(yǎng)的生物污染幾乎始終與實(shí)驗(yàn)次數(shù)、項(xiàng)目延期有關(guān),有時候甚至和實(shí)驗(yàn)室關(guān)閉或損失了稀缺的細(xì)胞有關(guān),導(dǎo)致浪費(fèi)了寶貴的時間和資源。
 
 

1:細(xì)胞培養(yǎng)中污染物的大小范圍從 100µm 到 50nm 不等,傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡很難觀察到最小的污染物(病毒和支原體)。
 
通常,有許多生物體在細(xì)胞培養(yǎng)物內(nèi)造成污染。它們包括:
  • 細(xì)菌
  • 真菌
  • 病毒
  • 酵母菌
  • 支原體
  • 真核細(xì)胞

這些污染物的表現(xiàn)方式各不相同,因此,需要不同的預(yù)防、檢測和清除策略。真菌、細(xì)菌和酵母菌隨著細(xì)胞一起快速生長,它們產(chǎn)生的污染不管是在宏觀上還是微觀上都很容易檢測到。支原體和病毒會感染細(xì)胞,但是由于它們太小很難直接檢測。真核細(xì)胞的污染常常表現(xiàn)為快速生長的細(xì)胞,用顯微鏡明顯可見,但是很難把它們和培養(yǎng)細(xì)胞區(qū)分開來,并且它們會逐漸取代培養(yǎng)物 [1]。

實(shí)驗(yàn)室的污染來源也同樣廣泛。有時候,污染物在細(xì)胞進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室時就已經(jīng)存在;這種情況最常見的是難以檢測的污染物,如真核細(xì)胞和支原體。細(xì)胞培養(yǎng)基等試劑是另一種來源,特別 是內(nèi)部制備和消毒的、多人使用的或是過期使用的。耗材也很 可能藏匿污染物,所以細(xì)胞培養(yǎng)時強(qiáng)調(diào)只使用一種無菌耗材的重要性。最后,無菌操作技術(shù)使用的疏忽也會引起污染。

在和污染的斗爭中,研究人員十分注重預(yù)防,因?yàn)椤?防患勝過補(bǔ)救 ”,F(xiàn)在,許多防范措施是細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范,比如高壓滅菌器消毒、使用預(yù)先制備的和預(yù)先消毒的培養(yǎng)基、無菌技術(shù)的培訓(xùn)、定期支原體檢測以及往細(xì)胞培養(yǎng)基中添加抗生素。然而,后者在現(xiàn)代細(xì)胞培養(yǎng)中不太普遍使用,因?yàn)榭茖W(xué)家們愈發(fā)意識到抗生素會影響細(xì)胞的生長和行為,因此偏向使用無抗生素培養(yǎng)基。

可是,即使實(shí)驗(yàn)室里采取最嚴(yán)苛的預(yù)防措施,仍然有很小的污 染風(fēng)險影響細(xì)胞培養(yǎng)。如果發(fā)生這種情況,必須迅速采取行動, 并且按照針對這些情況制定的規(guī)程應(yīng)對。盡管不同實(shí)驗(yàn)室的規(guī)程大不相同,但使用實(shí)驗(yàn)室的人采取的大多數(shù)行動都屬于此處討論的四個方面:
  • 清除
  • 確定污染程度
  • 找出原因
  • 后續(xù)執(zhí)行

清除
 
為了防止污染在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)擴(kuò)散或是再次發(fā)生,發(fā)現(xiàn)污染后最緊急的做法是進(jìn)行徹底清除。細(xì)菌、酵母菌和真菌孢子會急速擴(kuò) 散,常常無人注意,直到感染了其他培養(yǎng)基甚至是其他實(shí)驗(yàn)室。

清除的基本方面是追溯做過的步驟。即使是快速生長的污染物也需要一定時間才能生長到能檢測出的水平,這意味著當(dāng)污染物能在肉眼或顯微鏡下可見時,很可能它在培養(yǎng)基中已經(jīng)超過24 小時了。為此,重要的是要快速確定過去幾天和感染的培養(yǎng)基接觸過的所有區(qū)域、基質(zhì)、試劑和人。

首先,感染的培養(yǎng)器皿(多孔板、T 型培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)皿)應(yīng)經(jīng)過高壓蒸汽處理或消毒,然后丟棄。建議高壓蒸汽處理所有的培養(yǎng)器皿,因?yàn)檫@種方法安全可靠,可確保無殘留污染物遺留在培養(yǎng)器皿上。然后,按照正確的生物樣品處置途徑處置。

其次,清理感染的培養(yǎng)箱和生物安全柜。清理培養(yǎng)箱時,所有其他的培養(yǎng)物應(yīng)提前移開,可是為了避免可能的更大程度污染, 建議勿將培養(yǎng)物移到其他培養(yǎng)箱里培養(yǎng)。如有可能,將所有培養(yǎng)物暫時移進(jìn)生物安全柜或另一個培養(yǎng)箱,完成清理后放回原來的培養(yǎng)箱。

選擇一種消毒劑,它對存疑的污染物都有效,并且與使用的物料都適合,這點(diǎn)很重要。許多情況下,使用酒精消毒劑(70% 酒精或異丙醇)進(jìn)行日常清潔就很適合,但是某些情形可能需要用到其他的替代清潔劑(見表 1)。此外,有些培養(yǎng)箱有自動消毒功能,例如使用高溫,有助于快速便捷凈化污染后的培養(yǎng)箱(圖2)。有些培養(yǎng)箱甚至可能設(shè)置自動提醒程序,確保定期清潔消毒設(shè)備。
 

 圖 2:針對在 180℃ 條件下對 CO2 培養(yǎng)箱進(jìn)行消毒之前的標(biāo)準(zhǔn)化清潔程序,提供清晰的說明指導(dǎo)步驟,進(jìn)一步減少用戶操作失誤的可能,還應(yīng)使用可耐受高溫的傳感器。
 
 
1:常用實(shí)驗(yàn)室消毒劑的優(yōu)缺點(diǎn)(改編自[2])
 
只要正確使用生物安全柜,每次使用后有效清潔,那么不同使用者的培養(yǎng)物間傳染物的傳播風(fēng)險就低(圖3)。但是, 如果有任何跡象表明安全柜仍遺留有污染物,例如來自同一安全柜的重復(fù)感染,強(qiáng)烈推薦再另外使用酒精等消毒劑徹底清潔。雖然建議在日常維護(hù)中對生物安全柜進(jìn)行熏蒸,但除非有特殊情況,否則無需進(jìn)行熏蒸以控制污染[3]。
 


3:在細(xì)胞培養(yǎng)工作中,研究人員可以按照潔凈和臟污的材料劃分工作空間,從而降低污染的風(fēng)險。


最后,需要清理可能攜帶污染物的其他設(shè)備或工具,如水浴搖床和移液管。盡管在現(xiàn)代的細(xì)胞培養(yǎng)中,大多數(shù)接觸細(xì)胞和培養(yǎng)基的材料是一次性使用的,但最好檢查一下所有可能受到污染的物品是否已丟棄、經(jīng)過高壓蒸汽處理(如可能),或是另外消毒。

 
挽救稀有的培養(yǎng)物

絕大多數(shù)的污染情況會要求受污染的培養(yǎng)物做高壓蒸汽處理然后立即丟棄。但是,可能有培養(yǎng)物十分稀缺的情況。在這種情況下,研究人員可能要準(zhǔn)備好花費(fèi)大量的時間和資源嘗試“ 拯救 ”被污染的培養(yǎng)物。能否成功取決于污染的性質(zhì)和程度。此外,重要的是了解這些方法有無可能對潛在的細(xì)胞有重大的、而且往往是永久的影響,例如應(yīng)激信號級聯(lián)的激活 [4]。

當(dāng)一種細(xì)胞培養(yǎng)物受到快速生長的真核細(xì)胞一類的污染,比如 HeLa 或 HEK293 細(xì)胞系,有限稀釋可能是一種處理選擇。按低或甚至是單細(xì)胞密度稀釋并完成細(xì)胞鋪板可以幫助獲得極少量但很純凈的培養(yǎng)物,然后可培養(yǎng)繁殖并測試,比如使用短串聯(lián)重復(fù)序列分析(STR 分析)。

如果一種培養(yǎng)物受到了支原體的污染,有許多將其從培養(yǎng)細(xì)胞移除的方法可試。

盡管常用的抗生素(如盤尼西林和鏈霉素)無法殺死支原體,但也有可用的抗生素,比如四環(huán)素、大環(huán)內(nèi)酯類和喹諾酮。然而,大多數(shù)用于去除支原體的抗生素制劑都存在強(qiáng)細(xì)胞毒性,通常需要進(jìn)行數(shù)周進(jìn)行處理 [5]。

其他類型的污染,如細(xì)菌和真菌,向培養(yǎng)基快速釋放毒素,可以永久性地改變所有存活細(xì)胞的行為和代謝。這意味著從污染過的培養(yǎng)物取得的所有結(jié)果,其可靠性和復(fù)現(xiàn)性是存在質(zhì)疑的。然而,有些制造商提供的抗生素和抗真菌劑,結(jié)合廣泛的清洗和重新鋪板過程,可能會去除早期的感染。雖然如此,因?yàn)榧?xì)胞污染的負(fù)作用和進(jìn)一步擴(kuò)散的可能,這種方法不怎么建議使用。
 
確定污染程度

在清除后,甚至在清除時,有必要對污染程度進(jìn)行評估,確認(rèn)是否超出可接受程度。實(shí)驗(yàn)室成員間的溝通對此起到關(guān)鍵作用。實(shí)驗(yàn)室成員無論何時發(fā)現(xiàn)污染,都必須告知實(shí)驗(yàn)室責(zé)任管理人,他們可告知其他可能受影響的實(shí)驗(yàn)室使用者,并對之后的行動給出建議。這對大型公共平臺來說尤其重要。

在確定污染程度時,最需要了解的是,一種類型的污染物可以以不同的速度在不同的時間污染培養(yǎng)物。這意味著,當(dāng)一種培養(yǎng)物出現(xiàn)污染,其他培養(yǎng)物也可能有已經(jīng)出現(xiàn)相同污染的風(fēng)險,例如,同樣的培養(yǎng)基污染多個培養(yǎng)瓶或細(xì)胞系⸺即使還未到可見的程度。

為此,必須對所有可能受到污染的培養(yǎng)物進(jìn)行徹底檢查,避免忽略低程度的污染物,然后對其進(jìn)行隔離(如有可能)。這些措施應(yīng)持續(xù)幾天,避免有生長緩慢的生物體。至于支原體檢測,觀察活細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)顯微鏡不太可能發(fā)現(xiàn)污染,因?yàn)槠涮,這意味著有必要使用 PCR 進(jìn)行檢測。
 
找出原因

在采取所有控制污染傳播的措施后,有時候任務(wù)的困難之處在于查明原因。盡管許多污染的例子是一次性的事件,比如不恰當(dāng)無菌技術(shù)的后果,但還有許多其他情況是外部感染造成的,將來有可能還要感染其他培養(yǎng)物。為此,尋找源頭的措施應(yīng)立刻進(jìn)行,并且務(wù)必徹底,且應(yīng)由整個團(tuán)隊(duì)共同尋找,而非僅憑個人努力。

第一個需要問的問題是:有模式嗎?是否有些培養(yǎng)物受污染了而有些沒有,這可能是潛在源頭的線索,可以是很小、容易忽視的細(xì)節(jié)(圖 4)。如果整個實(shí)驗(yàn)室出現(xiàn)了這種問題,更可能是系統(tǒng)性的原因,比如通風(fēng)管道、濾器問題、高壓滅菌器問題等。

圖4:細(xì)胞培養(yǎng)中的污染可能存在許多不同的源頭。尋找一個模式可以有助于識別源頭

另一個有用的問題是:有什么改變?實(shí)驗(yàn)室,特別是科研實(shí)驗(yàn)室,可能缺乏某些規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)操作程序,所以仔細(xì)檢查實(shí)驗(yàn)室日志,看看最近采取的方法、采用的供應(yīng)商和設(shè)備變化,是找到原因的另一個好方法。

不管原因是否出在培養(yǎng)基和試劑上,建議丟棄曾發(fā)生污染培養(yǎng)物的低價值儲備溶液。這是因?yàn)槲廴居锌赡芤呀?jīng)從培養(yǎng)物擴(kuò)散到儲備溶液里了。對于高價值儲備溶液,應(yīng)進(jìn)行徹底的無菌檢查,確保可以安全使用。做法是在 T 型培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)樣品,并將培養(yǎng)瓶放在隔離培養(yǎng)箱隔離(圖 5)。

對原種進(jìn)行檢測是另一種例行程序,可以用來發(fā)現(xiàn)污染的原因,特別是當(dāng)培養(yǎng)物剛剛從液氮原液中恢復(fù)活力。檢測方法是另外從原種中凍融并鋪板一小瓶培養(yǎng)物,檢查是否存在污染。如果存在污染,應(yīng)該從之前的流程或使用新購買的儲備液重新開始培養(yǎng)。極少情況下,供應(yīng)的原種就已經(jīng)有污染,物應(yīng)盡快聯(lián)系供應(yīng)商告知他們所遇到的問題。在聯(lián)系供應(yīng)商時,盡可能獲取污染產(chǎn)品的信息很重要(準(zhǔn)確的產(chǎn)品名稱、產(chǎn)品號、批號等等),以便盡快解決所有的生產(chǎn)問題或物流問題。為了確保此批號始終可追蹤,有必要在等分樣時在每份樣品上標(biāo)記批號。

執(zhí)行這些操作后就無需使用常規(guī)的抗生素,還可確保培養(yǎng)的細(xì)胞準(zhǔn)確地代表了一種自然表型或疾病狀態(tài)。
圖5:隔離培養(yǎng)箱是限制污染傳播的一個好方法,也能挽救可能未受污染的細(xì)胞和試劑。

后續(xù)執(zhí)行
 
在所有的污染痕跡都被清理干凈,原因也被確定之后,有助于防止未來發(fā)生污染的最后一步是檢查是否需要做出任何整改措施?當(dāng)問題可能來自于試劑或耗材時,著重檢查所有物品是否從信譽(yù)良好的供應(yīng)商處購買,是否無菌,是否屬于細(xì)胞培養(yǎng)級別的物料,以及是否采用合適的方法運(yùn)輸、保存物料。

當(dāng)污染很可能是因?yàn)椴僮魇д`發(fā)生時,檢查并更新現(xiàn)有的規(guī)程可以幫助避免未來遇到這類問題。重要的是知曉錯誤可以在任何地方發(fā)生,以及對規(guī)程的簡單調(diào)整,例如關(guān)鍵步驟加上警示,可以幫助防止錯誤。另外,用戶培訓(xùn)有助于改善無菌工作效果,減少污染。

保存準(zhǔn)確、詳細(xì)的記錄對任何實(shí)驗(yàn)室都是至關(guān)重要的,無論如何,查找污染原因有時可以發(fā)現(xiàn)保存記錄中的問題。一次污染事件恰好可以成為一個契機(jī),以確保整個實(shí)驗(yàn)室的操作人員以準(zhǔn)確、標(biāo)準(zhǔn)的方式保存記錄。

盡管抗生素對防止污染有潛在的好處,但不建議在細(xì)胞培養(yǎng)中例行使用抗生素。許多抗生素顯示它們對細(xì)胞增殖和代謝有影響 [6]。當(dāng)細(xì)菌污染不斷發(fā)生時,有限使用抗生素有助于減少污染風(fēng)險。然而,預(yù)防細(xì)胞培養(yǎng)物污染通常應(yīng)通過培訓(xùn)和遵循良好的實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)范實(shí)現(xiàn)。
 
總結(jié)
 
污染對所有細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室都是一個持續(xù)風(fēng)險。盡管預(yù)防是減少污染煩擾的關(guān)鍵,但在狀況發(fā)生時,快速徹底且系統(tǒng)地行動在限制污染所造成的后果上是有幫助的。

盡管每個實(shí)驗(yàn)室處理污染會有不同的程序,但總體來說,分文概括的步驟對于最大限度減少污染的干擾,幫助實(shí)驗(yàn)室有效運(yùn)作提供了一個好的開始。

參考文獻(xiàn)
1. Neimark J. Line of attack. Science 2015; 347: 938–940.
2. Geraghty RJ et al. Guidelines for the use of cell lines in biomedical research. British Journal of Cancer 2014: 1–26.
3. Kennedy DA and Collins CH. Microbiological Safety Cabinets: Selection, Installation, Testing and Use.
British Journal of Biomedical Science 2000; 57(4): 330–7.
4. Ji Y et al. Mycoplasma Infection of Cultured Cells Induces Oxidative Stress and Attenuates Cellular Base Excision Repair Activity. Mutation Research 2019; 845.


關(guān)于 Eppendorf
Eppendorf 是一家領(lǐng)先的生命科學(xué)公司,專注于研發(fā)和銷售實(shí)驗(yàn)室的液體處理、樣品處理和細(xì)胞處理的儀器、耗材和服務(wù)。主要產(chǎn)品包括移液器、自動移液系統(tǒng)、分液器、離心機(jī)、混勻儀和分光光度計(jì)、 PCR 儀,以及超低溫冰箱、發(fā)酵罐、生物反應(yīng)器、二氧化碳培養(yǎng)箱、生物搖床和細(xì)胞顯微操作系統(tǒng)。相關(guān)耗材,如移液器吸頭、離心管、微量工作板和一次性生物反應(yīng)器,為高質(zhì)量的工作流程解決方案提供幫助。

Eppendorf 于 1945 年在德國漢堡成立,在全球擁有 3,600 多名員工。公司目前在 26 個國家設(shè)立了子公司,并在其他市場設(shè)立銷售體系。 隔離和檢疫 CO2
來源:艾本德中國
聯(lián)系電話:400 820 2559
E-mail:market.info@eppendorf.cn

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