基于非靶向的體內(nèi)微生物代謝譜識別食品基質(zhì)中的病原菌
發(fā)表期刊：Food Research International
影響因子：5.339
平臺：SPME/GC × GC- QTOF-MS
研究對象：微生物發(fā)酵液、空白發(fā)酵液、含菌食品（蝦、牛肉、豬肉和牛奶）、空白食品。
1.研究背景
目前，食源性病原菌是影響食品安全的首要因素，建立一種操作方便，有效實(shí)用的食源性病原體檢測方法顯得尤為重要。微生物揮發(fā)性有機(jī)物（MVOCs）檢測已經(jīng)成為揭示食品中病原菌腐敗和污染的一種新穎且有效的手段，但是，MVOCs種類繁多，受微生物種類、生長基質(zhì)、環(huán)境條件等多種因素影響，導(dǎo)致了MVOCs濃度差異巨大。
本文采用的新型的全二維色譜技術(shù)和疏水-親水平衡固相微萃�。⊿PME）探針技術(shù)具有物質(zhì)分離效果好，捕獲代謝物范圍廣的優(yōu)點(diǎn)。旨在通過對不同菌種的MVOCs檢測，尋找到不同微生物揮發(fā)性代謝標(biāo)志物。從而建立一種食源性致病菌識別新方法。
2.研究思路
3.研究結(jié)果
1. 質(zhì)譜方法優(yōu)化
本文的適用性驗(yàn)證基于聚合物復(fù)合萃取探針，將該探針與三個商用萃取探針相比較，包括DVB /CAR/ PDMS(50/30μm), PDMS / DVB(65μm)和PDMS(75μm)。從提取的Shigella sonnei MVOCs的總峰面積來看1-1，新型SPME探針具有較大的峰面積，提取效果最好。結(jié)合定性比較結(jié)果，PDMS或CAR/PDMS對雙極性化合物(如醇和酮)的靈敏度較低。與DVB/CAR/ PDMS相比，新型SPME探針具有更高的保留能力，更適合于提取不同理化性質(zhì)的MVOCs。因此，新型的SPME探針有助于提供更全面的MVOCs譜，為我們后續(xù)的實(shí)驗(yàn)提供了有力的工具。考察了氣相爐升溫速率和萃取時間對萃取效果的影響。優(yōu)化結(jié)果如圖1-2，1-3所示。在初始溫度不變的條件下，以5℃ /min的加熱速率從50 ℃~ 230℃，對MVOCs的檢測靈敏度優(yōu)于其他加熱方案。同樣，為了獲得更好的提取效果，根據(jù)圖1-3中總峰面積隨提取時間的延長而增加的結(jié)果，選擇60 min作為最佳條件。
圖1 1-1SPME探針纖維（左）；1-2溫度程序（中）；1-3提取時間（右）
2. MVOCs的鑒定與分析
優(yōu)化后，將所建立的方法應(yīng)用于5種食源性致病菌體內(nèi)揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的檢測，共鑒定出126種MVOCs為與細(xì)菌生長和代謝活性相關(guān)的優(yōu)勢代謝產(chǎn)物。圖2-C為五種食源性致病菌的MVOCs的PCA分析，顯示了它們之間響應(yīng)性代謝特征的分離，并初步評價了實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性。不同菌株間鑒定的代謝物的主要化學(xué)類別如圖2-A所示。主要的基團(tuán)是酯類、烴類、醇類、酮類，其次是吡嗪類。在傷寒沙門氏菌(55.56%)、金黃色葡萄球菌(26.32%)和大腸桿菌(24%)中檢出大量碳?xì)浠衔铩８比苎曰【袩N類含量較低(3.57%)。其中，桑內(nèi)志賀氏菌(34.38%)和金黃色葡萄球菌(26.32%)的酯類含量特別高。酮和醇的比例相近，吡嗪的含量低于其他四種。圖2B為五種致病菌獨(dú)有和共享的揮發(fā)物的維恩圖。具體來說，所有被研究的細(xì)菌都共用十二烷。2,4-二叔丁基苯酚和2-乙基己醇由副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌和大腸桿菌共同擁有。此外，副溶血性弧菌與鼠傷寒沙門氏菌和大腸桿菌共有2-十五烷酮、鄰苯二甲酸二異丁酯和鄰苯二甲酸二丁酯，與松內(nèi)志賀氏菌和大腸桿菌共享1-辛醇和1-癸醇。金黃色葡萄球菌、志賀菌和大腸桿菌共享十八烷，前兩種菌共有2,5-二甲基-3-異戊基吡嗪和2-戊基呋喃，后兩種菌共有苯乙酮和3-苯基呋喃。痢疾志賀氏菌、鼠傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌與十一烷共有，而桑氏志賀氏菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌與2,6-二乙基吡嗪共有。大腸桿菌與溶血性弧菌、鼠傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌分別共有吲哚、環(huán)戊烷酮和2,5-二甲基吡嗪。副溶血性弧菌分別與鼠傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌共有(z)-6-pentadecen-1-ol和二甲基三硫。
圖2 五種食源性病原體的主要化學(xué)類別的分布(A)；五種食源性病原體所釋放的獨(dú)特和共有的揮發(fā)性代謝物的維恩圖(B)；5種食源性致病菌MVOCs的PCA圖（C）
3. 微生物的代謝生物標(biāo)志物圖譜
微生物的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物深受培養(yǎng)基的影響，因此進(jìn)一步分離和分析培養(yǎng)基與微生物之間的差異，對于尋找微生物獨(dú)特的代謝標(biāo)志物具有重要意義。分別構(gòu)建了5個OPLS-DA模型來區(qū)分5個研究純菌株及其無菌培養(yǎng)基的代謝產(chǎn)物譜。結(jié)果如圖3所示。然后用VIP值超過1作為卡值標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果如圖4所示。不考慮培養(yǎng)基的影響，多變量篩選得到22個差異代謝物。為了進(jìn)一步明確有效的生物標(biāo)記。在圖5中考慮了純培養(yǎng)基與菌株峰面積的比較。與無菌培養(yǎng)基相比，吲哚、2-十一烷、降植烷、2-己基呋喃、1-壬醇、丁基羥基甲苯、1-癸醇、3-甲基丁酸、2-十二烷酮、甲基-2,4-癸烯酸甲酯和2-十四烷酮的峰面積顯著增加。說明上述物質(zhì)是菌株自身代謝的優(yōu)勢化合物。結(jié)合前人研究，五種食源性致病菌的潛在揮發(fā)性代謝標(biāo)志物如下1-壬醇(志賀菌)、丁基羥基甲苯(志賀菌)、2-己基呋喃(志賀菌)、降植烷(鼠傷寒桿菌)、1-癸醇(大腸桿菌)、甲基-2,4-癸烯酸甲酯(金黃色葡萄球菌)、2-十二烷酮(金黃色葡萄球菌)、3-甲基丁酸(金黃色葡萄球菌)、以及2-十四酮(金黃色葡萄球菌)。吲哚是大腸桿菌和副溶血性弧菌共同擁有的潛在的揮發(fā)性標(biāo)記物。
圖3 微生物培養(yǎng)體系與空白微生物培養(yǎng)基揮發(fā)性代謝物的OPLS-DA得分圖
圖4 通過OPLS-DA分析，得到5種致病菌的總化合物
圖5 菌株與無菌培養(yǎng)基差異變量的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果
4. 食品中五種致病菌潛在揮發(fā)性標(biāo)記物的檢測
食物基質(zhì)可能不同于肉湯培養(yǎng)系統(tǒng)。因此，通過實(shí)際食品樣本驗(yàn)證新型SPME探針在病原細(xì)菌識別中發(fā)現(xiàn)的潛在揮發(fā)性標(biāo)記物，以支持所建立方法的實(shí)用性。根據(jù)細(xì)菌宿主的實(shí)際情況，對蝦、牛肉、豬肉和牛奶三種食物基質(zhì)進(jìn)行了調(diào)查。分別測定了各細(xì)菌在相應(yīng)的食物基質(zhì)和培養(yǎng)基上生長的潛在揮發(fā)性標(biāo)記物的峰面積，其產(chǎn)率隨時間的變化曲線如圖6所示。受污染的食品樣本中金黃色葡萄球菌的3-甲基丁酸和2-十一烷酮、大腸桿菌的吲哚和1-癸醇、副溶血性弧菌的吲哚和2-十一烷酮的信號強(qiáng)度先升高后降低。鼠傷寒沙門氏菌的降植烷和金黃色葡萄球菌的甲基-2,4-癸烯酸甲酯以及2-十四烷酮的信號強(qiáng)度逐漸升高。食物中致病菌代謝標(biāo)志物濃度的變化與細(xì)菌在培養(yǎng)基中的生長趨勢一致。另外，上述化合物均未在實(shí)際樣品的對照組中檢測到。結(jié)果表明，食物基質(zhì)中的微生物利用食物中豐富的營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行自身生長繁殖，并繼續(xù)產(chǎn)生自己獨(dú)特的代謝產(chǎn)物。
圖6 分別在培養(yǎng)基和食物基質(zhì)中培養(yǎng)的菌株潛在揮發(fā)性化合物的信號強(qiáng)度隨時間變化的結(jié)果:(A)大腸桿菌;(B)鼠傷寒沙門氏菌;(C)副溶血性弧菌;(D)桑氏志賀氏菌;(E)金黃色葡萄球菌。
4.結(jié)論
本研究成功地將新型SPME探針與GC×GC-Q-TOF-MS相結(jié)合，應(yīng)用于五種食源性致病菌體內(nèi)揮發(fā)性代謝物的檢測。通過多元統(tǒng)計(jì)分析，篩選出11個潛在的揮發(fā)性標(biāo)記物，并在特定的食品基質(zhì)中進(jìn)行了驗(yàn)證
本研究結(jié)果突出了體內(nèi)揮發(fā)性代謝物作為食源性致病菌生長和代謝狀態(tài)指標(biāo)的適用性，為微生物代謝組學(xué)的研究提供參考，該方法可為微生物識別提供一種簡單、高效、靈敏的替代方法。
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