完整人體器官三維重現(xiàn):近紅外光片顯微鏡的應(yīng)用案例

瀏覽次數(shù)：1472　發(fā)布日期：2021-4-21　

本文要點：作者介紹了一種叫SHANEL(小膠束介導(dǎo)的人體器官高效清除和標(biāo)記)的方法來使完整的成人組織器官變得透明。同時，通過SHANEL清除與近紅外光片顯微鏡的聯(lián)用，使成像深度達(dá)到厘米級，從而進(jìn)行3D組織學(xué)研究。作者在細(xì)胞分辨率上揭示了完整的人眼、人甲狀腺、人腎和轉(zhuǎn)基因豬胰腺等結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)。

人體器官的結(jié)構(gòu)和功能圖譜是各種生物醫(yī)學(xué)研究的重要內(nèi)容，例如許多國家都啟動了自己的“人腦圖譜”項目。然而，這些項目在重現(xiàn)人體器官復(fù)雜的解剖結(jié)構(gòu)上的進(jìn)展都十分有限，究其原因，主要是因為缺乏在細(xì)胞水平上對人體器官進(jìn)行成像的可靠技術(shù)。傳統(tǒng)的磁共振成像(MRI)只能為人體器官提供縱向成像，缺乏細(xì)胞分辨率。近紅外染料由于其光學(xué)特性，相比可見光染料具有成像深度深的優(yōu)勢，配合全新的近紅外光片顯微鏡可以對厘米級的人體器官進(jìn)行細(xì)胞和分子水平的成像，并在后期通過數(shù)據(jù)處理進(jìn)行3D重現(xiàn)。

SHANEL是作者開發(fā)的一種通過形成小膠束，在大型哺乳動物器官中完全擴(kuò)散并改善組織網(wǎng)，使生物組織完全透明的方法，用于進(jìn)一步細(xì)胞和分子成像。作者首先實現(xiàn)了在1.5個月內(nèi)使大小為12.0 * 7.3 * 5.0 cm的豬腦透明，清理后的豬腦大小為7.5 * 5.0 * 3.3 cm，體積縮小率為30%（圖1A-C）。作者再將SHANEL清除法應(yīng)用于INS-EGFP（胰島β細(xì)胞特異性表達(dá)EGFP基因）轉(zhuǎn)基因豬胰腺（圖1D-F）。通過該方法可以很容易地評估胰島內(nèi)單細(xì)胞或細(xì)胞群的胰島β細(xì)胞的三維分布，從而能夠量化胰島體積和顯示胰島的異質(zhì)性（圖1G-L）。

圖1.成年豬腦和胰腺的Shanel清掃
(A)-(C) 成年豬腦和胰腺的Shanel清掃
(D)-(F) 成年豬胰腺的Shanel清掃
(G) 光片顯微鏡成像的B細(xì)胞胰島的三維分布。
(H) 中標(biāo)記的區(qū)域的高倍率視圖。
(I) 中標(biāo)記的標(biāo)記的區(qū)域的高倍鏡視圖
(J和K) 胰島內(nèi)B細(xì)胞體積的節(jié)段性三維分布。
(J)中的標(biāo)記區(qū)域在(K)中以高倍率顯示。
(L) 對檢測到的小島總數(shù)進(jìn)行量化，并按其體積進(jìn)行分類。

在對豬腦和豬胰腺進(jìn)行完整成像后，作者的下一個目標(biāo)是對完整人腦進(jìn)行成像。由于活體基因標(biāo)記和熒光染料示蹤不適用于死后人體組織的研究，因此對人體器官的細(xì)胞和分子成像需要死后使用染料和抗體進(jìn)行染色。然而，抗體標(biāo)記技術(shù)在組織學(xué)中被限制在50um厚度，若先行清掃則最大成像深度為1毫米，這主要是由于組織的弱通透性和抗體在組織內(nèi)擴(kuò)散緩慢。作者首先建立了一個壓力驅(qū)動的泵送系統(tǒng)，使所有的清洗劑和細(xì)胞核標(biāo)記染料通過四條動脈循環(huán)到達(dá)人腦的所有部位。作者用SHANEL清掃法對92歲女性捐贈者的完整人腦進(jìn)行透明化處理（圖2A-B）。然后用IBA1(離子化鈣結(jié)合分子1)抗體標(biāo)記小膠質(zhì)細(xì)胞(圖2C-2J)和PI(碘化丙啶)標(biāo)記細(xì)胞核。作者觀察到與白質(zhì)相比，灰質(zhì)中的小膠質(zhì)細(xì)胞大多更大，分支更多。接下來，作者使用TH（酪氨酸羥化酶）抗體免疫標(biāo)記神經(jīng)元結(jié)構(gòu)、用PI標(biāo)記細(xì)胞核（圖2K–2N）。作者能夠在1.8*1.8*1.5cm的人腦切片上觀察到特異性標(biāo)記的軸突延伸（圖2K–2N）。

圖2.光片顯微鏡拍攝的人腦組織

(A-B) SHANEL清掃處理人腦。

(C-F) IBA1（綠色）標(biāo)記和PI（洋紅）標(biāo)記。

小膠質(zhì)細(xì)胞密度和形態(tài)的差異在整個灰質(zhì)(G和H)和白質(zhì)(I和J)都很明顯。

接下來，作者將SHANEL技術(shù)和光片顯微鏡進(jìn)一步應(yīng)用到人體腎臟的整體成像。目前腎臟捐贈者嚴(yán)重短缺，其中很大一部分患者等待腎移植，等待時間可能長達(dá)數(shù)年，移植費用可能高達(dá)50萬美元。了解人類腎臟的3D結(jié)構(gòu)對于利用3D生物打印技術(shù)制造人造腎臟非常有價值。作者用SHANEL組織學(xué)方法實現(xiàn)了腎臟的完全透明，通過腎動脈灌注TRITC-dextran和TO-PRO3染料，標(biāo)記全腎的血管和致密的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。圖中清楚顯示了主要的腎動脈、段動脈的二級分支和葉間動脈（圖3A-C）。通過光片顯微鏡，我們可以顯示大體積(1.2 * 1.2 * 0.45 cm)腎皮質(zhì)內(nèi)血管和腎小球的三維分布，并追蹤單個傳入小動脈及其相應(yīng)的腎小球(圖3D-F)。經(jīng)皮質(zhì)剖面計數(shù)，皮質(zhì)帶寬度約為2742±665 mm，腎小球卡尺直徑為221±37 mm，傳入小動脈直徑為71±28 mm(圖3G)。

圖3.人腎的細(xì)胞學(xué)研究

(A-C) SHANEL清掃腎臟

(D) 用光片顯微鏡對(C)所示的腎皮質(zhì)區(qū)域的血管和腎小球進(jìn)行三維重建。

(E-F) 高倍率光片顯微鏡(E)和共聚焦顯微鏡(F)圖像顯示了

傳入小動脈(洋紅色)和腎小球(綠色)的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)。

(G) 3D重建的人體腎臟解剖和皮質(zhì)剖面。

為了能夠?qū)ν暾娜梭w腎臟成像，作者使用了一臺具有平臺運動功能和大的樣品容納室(大小為25*9*7厘米)的光片顯微鏡(圖4A-E)。我們對一位93歲捐獻(xiàn)者的腎臟(11.*6.5*5厘米)進(jìn)行了端到端掃描(圖4F-I)。在780nm自熒光通道，作者觀察到很大一部分腎皮質(zhì)中的血管結(jié)構(gòu)顯著減少(圖4J和4K)，這在dextran通道中也很明顯(圖4H)。切片的PAS染色，表明兩側(cè)的腎小球結(jié)構(gòu)相似(圖4L)。這些數(shù)據(jù)表明，作為老年人高血壓相關(guān)變化的典型表現(xiàn)，血管病理可能先于腎小球病理影響到腎臟功能。通過該實驗，作者證明了SHANEL技術(shù)和近紅外光片顯微鏡的聯(lián)用可以成為研究完整人體器官病理學(xué)的新工具，為了解器官在疾病中的進(jìn)展提供有價值的信息。