急性腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ褪茄芯磕X血管病病理機(jī)制和防治措施不可缺少的工具。由于臨床上缺血性卒中大多是由于大腦中動(dòng)脈區(qū)域梗死造成，因此人們普通采用血管內(nèi)線栓法模型，但是由于該模型制作變異性大，而且動(dòng)物長期存活率低，致使實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差。

后來經(jīng)過學(xué)者們不斷的摸索優(yōu)化，發(fā)明了開顱后夾閉大腦中動(dòng)脈(而非電凝)聯(lián)合雙側(cè)頸總動(dòng)脈夾閉的大鼠三血管阻塞模型(3-vessel occlusion， 3-VO) ，由于該方法可同時(shí)導(dǎo)致大鼠皮質(zhì)和基底節(jié)缺血，被認(rèn)為是最接近人類卒中的標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物模型，適用于腦缺血后長期神經(jīng)功能缺失的康復(fù)及介入治療研究中。另外，該模型因其缺血較為迅速、缺血效果好、再灌注血流恢復(fù)迅速而更加適用于急性缺血性疾病的研究。

•小鼠：C57BL6J CD-1等小鼠，常用雄性小鼠，體重25-35g

•大鼠：Sprague-Dawley(SD)、Wistar等多種小鼠，常用雄性大鼠，體重250~350g

1.大鼠手術(shù)操作步驟

•將大鼠置于手術(shù)臺(tái)上,取仰臥位,用10m注射器大小的管子放置在大鼠頸后,以加強(qiáng)雙側(cè)頸總動(dòng)脈的顯露。

(1)剃掉頸部和腹側(cè)的毛,用75%的乙醇棉球或聚維酮碘進(jìn)行局部皮膚消毒,頸部中線做一個(gè)切口,分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈,雙動(dòng)脈下穿線;分離頸總動(dòng)脈時(shí)小心分離伴行的迷走神經(jīng)纖維,以免受損傷。

(3)將大鼠體位改為左側(cè)臥位。

(4)在大鼠右眼滴加1~2滴人工淚液,閉上眼瞼,避免手術(shù)中對(duì)眼睛造成損傷;剃掉右側(cè)外耳道和右眼外之間的皮毛,使用聚維酮碘局部皮膚消毒,75%乙醇脫碘,在兩個(gè)位置連線中點(diǎn)做一切口,長度約2cm。

(5)用止血鉗拉開切口,切斷顳肌,分離肌肉,暴露顴弓。操作工程中要注意保護(hù)腮腺和面神經(jīng)。

(6)用咬骨鉗移除顴弓,用牽張器撐開下頜骨與顴弓,暴露前庭窗;用1.4mm鉆頭的骨鉆在前庭窗的前3mm、下1mm處鉆孔,鉆頭浸在室溫的鹽水中,以免在鉆洞過程中造成皮質(zhì)熱或物理損傷。在顯微鏡下透過硬腦膜即可看見大腦中動(dòng)脈,垂直于嗅束向上走行。

(7)用針頭挑破硬腦膜,分離大腦中動(dòng)脈周圍的蛛網(wǎng)膜,暴露大腦中動(dòng)脈。用顯微鑷在接近嗅束處將大腦中動(dòng)脈挑起,用無創(chuàng)微動(dòng)脈夾夾閉或尼龍線結(jié)扎大腦中動(dòng)脈,夾閉結(jié)扎位置在其分支豆紋動(dòng)脈之前或靠近頸內(nèi)動(dòng)脈處。將顳肌和表面皮膚覆蓋回位,用浸透人造腦脊液的紗布覆蓋。

(8)在阻斷大腦中動(dòng)脈同時(shí),通過尼龍線套扣阻斷雙側(cè)頸總動(dòng)脈的血流(見圖1和圖2)。

(9)缺血1~2h后頸總動(dòng)脈的動(dòng)脈瘤夾/縫線和大腦中動(dòng)脈的縫線都被松開,在顯微鏡下直接觀察3個(gè)動(dòng)脈血流的恢復(fù)。

(10)再灌注20min后,用牙科膠泥封閉顱骨手術(shù),再分別縫合切口。允許大鼠麻醉蘇醒后自由進(jìn)食水。所有大鼠在能通風(fēng)換氣的(24±0.5)℃孵箱中直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

(a) 在左側(cè)眼外眥至外耳道之間做長約2cm的切口;(b)暴露顳肌,純性分離并牽開顳肌；(c)以卵圓窩或者下領(lǐng)神經(jīng)前方3cm、側(cè)方1cm的鱗骨為中心，鉆一直徑為2~4mm的小孔；(d)移去顱骨；(e)暴露大腦中動(dòng)脈區(qū)域；(f)剪開需扎閉區(qū)域周圍硬腦膜，用10-0或11-0的帶針縫合線結(jié)；大腦中動(dòng)脈；(g)手術(shù)示意圖；(h)結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈。

注:雙側(cè)頸總動(dòng)脈、右側(cè)大腦中動(dòng)脈結(jié)扎造成大腦中動(dòng)脈區(qū)域持續(xù)、穩(wěn)定的缺血

2.小鼠手術(shù)操作步驟

小鼠的手術(shù)操作流程與大鼠基本相同，不同之處是用更小的動(dòng)靜脈畸形血管夾。

1.注意事項(xiàng)

•麻醉劑對(duì)梗死體積的作用

在麻醉和手術(shù)過程中對(duì)大腦缺血模型都是有影響的。麻醉劑在大腦缺血的病理生理中有重要作用。因此,筆者比較了不同麻醉劑對(duì)缺血梗死體積的影響,發(fā)現(xiàn)水合氯醛是這模型的理想麻醉劑。

水合氯醛是鎮(zhèn)靜劑，用于治療失眠的短效藥物，可緩解焦慮，在手術(shù)前誘導(dǎo)睡眠或治療乙醇戒斷癥狀，也可用于術(shù)后緩解疼痛。用水合氯醛比用其他的麻醉藥(如氯胺酮、賽拉嗪、乙醚和異氟醚)模型的梗死體積和結(jié)扎時(shí)間有更好的相關(guān)性。水合氯醛的另一優(yōu)點(diǎn)在于不是管制藥品,在購買和存放時(shí)減少了很多限制要求。

•血糖對(duì)梗死體積的影響

在臨床研究中發(fā)現(xiàn)，血糖水平是缺血腦損傷一個(gè)主要的決定因素。三血管MCAO模型也證實(shí)血糖水平對(duì)缺血結(jié)果有重要影響。高血糖導(dǎo)致梗死體積明顯增大，并且高血糖是缺血期間最有害的因素，反之低血糖則能減少梗死體積。在治療窗內(nèi)使血糖恢復(fù)正常能有效減少梗死體積。

然而，血糖對(duì)腦缺血作用的分子機(jī)制還不清楚。缺血前禁食24h能減少缺血24h后的腦損傷,這一作用持續(xù)至再灌注后28d。盡管COX-1基因治療能在缺血24h后減少大腦梗死體積，但是在再灌注后的28d未見其持續(xù)的保護(hù)作用。這些結(jié)果均表明血糖對(duì)缺血腦損傷有重要作用,且是評(píng)價(jià)缺血的遠(yuǎn)期預(yù)后的一個(gè)重要因素。

•腦水腫對(duì)梗死體積的影響

在局灶性腦缺血的動(dòng)物模型中，通過特殊組織染色觀察每一個(gè)腦片的梗死部位，通常通過測(cè)量這些梗死面積來確定梗死體積。

形態(tài)學(xué)測(cè)定分析梗死體積是一個(gè)客觀并且定量的評(píng)估缺血腦損傷程度的方法，同時(shí)這種方法在臨床前的研究中常被用于判斷神經(jīng)保護(hù)劑的有效性。然而，腫脹的缺血組織可能導(dǎo)致測(cè)得的梗死區(qū)域增大，因此高估了實(shí)際的梗死體積。把腦水腫包括在梗死體積內(nèi)計(jì)算可使實(shí)際的梗死體積增加多達(dá)22%。

因此，因腦水腫引起的梗死體積失真可能使得干預(yù)治療的有效與否難以解釋。可通過測(cè)量皮質(zhì)的水含量和MRI確定在這一模型缺血損傷后的1~3d腦水腫的嚴(yán)重程度來減少因腦水腫導(dǎo)致的誤差，Swanson等提出了一種基于正常存活的灰質(zhì)體積來計(jì)算梗死體積的方法，這一方法進(jìn)一步被林等證實(shí)。

顯然，以前直接測(cè)量梗死體積的方法在缺血后前3d腦水腫進(jìn)展期間所測(cè)得的數(shù)據(jù)要高于實(shí)際梗死體積，這一誤差能通過基于對(duì)非梗死皮質(zhì)體積的間接測(cè)量得以減少。

•性別對(duì)梗死體積的影響

流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，女性(直至絕經(jīng)后,即55歲后)心血管病的患病率低于男性，卒中的發(fā)病率也是如此。有短暫性缺血發(fā)作或小卒中的女性發(fā)病率低于男性。動(dòng)物研究也表明性別不同，卒中的結(jié)果不同。在三血管MCAO模型中，雄性比雌性大鼠的梗死體積更大。當(dāng)在三血管MCAO模型中混有雄性和雌性大鼠時(shí)，應(yīng)該考慮性別的影響。

•溫度對(duì)梗死體積的影響

研究發(fā)現(xiàn)，即使是輕微的大腦溫度降低，也能對(duì)缺血損傷的大腦起到保護(hù)作用。Connolly等的研究顯示，MCAO模型后，小鼠無法自我調(diào)節(jié)體溫，在保護(hù)期出現(xiàn)嚴(yán)重的低溫，而這種體溫變化對(duì)MCAO模型后病理結(jié)果有顯著的影響，是損傷了下丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞所致。

2.常見問題及解決方法

•梗死面積太小

在該模型中，選擇截?cái)啻竽X中動(dòng)脈主干血流的部分十分重要。實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為只有在鼻裂間隙正上段部位的血流阻斷才能得到相對(duì)合適的梗死范圍。

•損傷腦組織或出血

在手術(shù)阻斷大腦中動(dòng)脈主干時(shí)，電凝或結(jié)扎該血管都很容易造成鄰近此血管的腦組織損傷，如果電凝不到位或結(jié)扎過于用力，或手術(shù)操作粗暴，都極易損傷大腦中動(dòng)脈主干，從而導(dǎo)致大出血，使手術(shù)失敗。

*以上內(nèi)容部分源自《實(shí)驗(yàn)卒中模型方法學(xué)》

書號(hào)：ISBN 978-7-313-21776-9

了解更多卒中模型方法

歡迎掃碼咨詢