類風濕性關節(jié)炎(RA)是一種由白細胞功能失調引起的疾病，研究數(shù)據(jù)顯示腸道細菌或微生物群的變化可影響RA的正常免疫系統(tǒng)功能。調節(jié)性B細胞(Bregs)是一種免疫抑制細胞，它通過產(chǎn)生白細胞介素(IL)-10, IL-35和轉化生長因子-1 (TGFβ1)介導免疫耐受，從而抑制多種免疫病如自身免疫性疾病。英國倫敦大學學院Claudia Mauri和Elizabeth C. Rosser研究團隊發(fā)現(xiàn)補充丁酸鹽可改變微生物群的組成，增加血清素衍生代謝物5-羥基吲哚-3-乙酸（5-HIAA）的產(chǎn)生，激活芳烴受體(AhR)抑制生發(fā)中心(GC) B細胞和漿細胞的分化以維持Bregs功能從而改善關節(jié)炎，相關成果發(fā)表于《Cell Metabolism》。

RA患者糞便丁酸鹽降低與CD19⁺CD24^hiCD38^hiB細胞和IL-10⁺Breg頻率降低相關

腸道微生物群的生態(tài)失調可能是RA發(fā)病的一個促進因素，本研究團隊已報道CD19⁺CD24^hiCD38^hiB細胞中高比例的IL-10⁺Bregs的頻率與RA嚴重程度呈負相關。微生物來源的SCFAs對維持免疫穩(wěn)態(tài)至關重要，因此，作者推測RA的生態(tài)失調可能影響SCFAs，導致B細胞穩(wěn)態(tài)異常和Breg頻率降低。本研究招募非活動性RA患者收集糞便和血清樣本進行代謝組學分析，發(fā)現(xiàn)與年齡和性別匹配的健康對照(HCs)相比，RA患者糞便中丁酸鹽和丙酸鹽顯著減少，而乙酸鹽沒有差異(圖1A)。在RA患者中丁酸鹽水平與總CD19⁺CD24^hiCD38^hiB細胞和IL-10⁺B細胞的頻率呈顯著正相關(圖1D,1G)。丙酸鹽或乙酸鹽與CD19⁺CD24^hiCD38^hiB細胞或IL-10⁺Breg頻率無明顯相關性(圖1B-1F)，表明丁酸鹽在維持關節(jié)炎疾病中Breg穩(wěn)態(tài)方面起作用。

丁酸鹽依賴于Bregs抑制實驗性關節(jié)炎

對抗原誘導的關節(jié)炎模型(AIA)小鼠糞便SCFA水平進行分析，發(fā)現(xiàn)與關節(jié)炎前小鼠相比，急性期和緩解期關節(jié)炎小鼠丁酸鹽和乙酸鹽含量下降(圖2A, S2A)。為評估個體SCFA在控制關節(jié)炎嚴重程度方面的作用，并確定B細胞在介導抑制中的可能作用，疾病誘導前在野生型(WT)小鼠和B細胞缺陷(μMT)小鼠的飲用水中添加乙酸鹽、丙酸鹽和丁酸鹽，發(fā)現(xiàn)與對照組(兩種基因型的對照小鼠均接受鹽和pH平衡的飲用水)相比，僅補充丁酸鹽就可以減輕WT小鼠關節(jié)炎(圖2B)。而丁酸鹽未能抑制μMT小鼠疾病情況(圖2C)，表明在實驗條件下B細胞是實現(xiàn)丁酸鹽有利效應的關鍵。在缺乏產(chǎn)生IL-10的B細胞混合骨髓嵌合小鼠中，補充丁酸鹽未能抑制關節(jié)炎(圖2b)，表明丁酸鹽介導的關節(jié)炎抑制需要Bregs。丁酸鹽能抑制膠原誘導性關節(jié)炎的嚴重程度，進一步說明丁酸鹽在關節(jié)炎中的抗炎作用(圖S2F)。

補充丁酸鹽使B細胞室傾斜有利于調節(jié)表型

利用IL-10eGFP報告基因小鼠的優(yōu)勢，使活躍轉錄IL-10的B細胞可視化以研究丁酸鹽對促關節(jié)炎的細胞和Bregs的影響。補充丁酸鹽的IL-10eGFP報告基因小鼠的疾病改善與野生型小鼠相似（圖2C和2D分別顯示了關節(jié)的臨床評分和組織學變化）。在丁酸鹽對Bregs分化影響方面，補充丁酸鹽的小鼠和對照組小鼠IL-10eGFP⁺CD19⁺CD21^hiCD24^hiBreg數(shù)目和頻率相似(圖2E)，CD19⁺CD138⁺Blimp-1⁺漿母細胞和CD19⁺CD95⁺GL7⁺GC（生發(fā)中心）B細胞的頻率和數(shù)量顯著降低(圖2F和2H)。盲法組織學分析進一步證實，補充丁酸鹽的小鼠和對照組小鼠每個B細胞卵泡的GCs數(shù)量和大小減少（圖2J）。因此，與對照組小鼠相比，丁酸鹽的添加增加了IL-10eGFP⁺CD19⁺CD21^hiCD24^hiBreg相對于漿母細胞與IL-10eGFP⁺CD19⁺CD21^hiCD24^hiBreg相對于GC B細胞的比例(圖2G和2I)。為了確定丁酸鹽是否會影響B(tài)regs免疫抑制功能，從補充丁酸鹽或對照IL-10eGFP報告小鼠中分離同等數(shù)量的IL-10eGFP⁺CD19⁺CD21^hiCD24^hiBregs并轉移到同基因關節(jié)炎宿主中，結果顯示相比對照組，丁酸鹽補充小鼠的IL-10eGFP⁺CD19⁺CD21^hiCD24^hiBregs在過繼轉移時發(fā)揮了更強的抑制能力(圖2K)。綜上結果表明，補充丁酸鹽同時增加Breg抑制能力，限制GC B細胞和漿母細胞的分化。

丁酸鹽抑制關節(jié)炎需要B細胞表達AhR

前期研究表明AhR能夠抑制漿母細胞分化，作者假設“補充丁酸鹽通過激活B細胞中的AhR直接或間接改變B細胞亞群組成能夠抑制關節(jié)炎”。根據(jù)上述假設，與對照組小鼠相比，從補充丁酸鹽小鼠中分離出的AhR激活的原型報告基因Cyp1a1表達顯著上調(圖3A)。與野生型小鼠相似，補充丁酸鹽僅在AhR充足的Mb1^cre/+小鼠中抑制了關節(jié)炎的嚴重程度和CD4⁺IL-17⁺T細胞的頻率，而在Ahr^fl/-Mb1^cre/+（具有AhR的B細胞特異性缺失）小鼠中尚未觀察到（圖3B）。相比Mb1^cre/+小鼠，來自Ahr^fl/-Mb1^cre/+小鼠的B細胞釋放的IL-10較少，即使補充丁酸鹽也無法緩解IL-10的減少（圖3C）。與對照組比較，丁酸鹽補充并未改變Mb1^cre/+或Ahr^fl/-Mb1^cre/+小鼠中CD19⁺CD21^hiCD24^hiB細胞的頻率和數(shù)量 (圖3D)。與圖2F, 2H結果一致，丁酸鹽補充減少了Mb1^cre/+小鼠的CD19⁺CD139⁺ Blimp-1⁺漿母細胞和CD19⁺ CD95⁺ GL7⁺ GC B細胞的頻率和數(shù)量，卻不能抑制Ahr^fl/-Mb1^cre/+小鼠中上述細胞（圖3E和3F）。由于炎癥是Breg分化和功能的驅動因素，相比Mb1^cre/+小鼠，Ahr^fl/-Mb1^cre/+小鼠出現(xiàn)更嚴重的關節(jié)炎炎癥。

補充丁酸鹽可維持Breg抑制功能并部分通過AhR依賴性轉錄控制B細胞分化

丁酸鹽是如何維持Breg抑制功能并抑制GC B細胞和漿母細胞的分化？在對照組和補充丁酸鹽的Mb1^cre/+小鼠CD19⁺CD21^hiCD24^hiB細胞中，有412個顯著差異表達基因(DEGs)(圖4A)。與對照組Ahr^fl/-Mb1^cre/+小鼠CD19⁺CD21^hiCD24^hiB細胞相比，丁酸鹽補充組有566個顯著的DEGs。信號通路分析(SPIA)顯示，內質網(wǎng)蛋白加工通路在丁酸鹽補充Mb1^cre/+小鼠CD19⁺CD21^hiCD24^hiB細胞中顯著下調，在Ahr^fl/-Mb1^cre/+CD19⁺CD21^hiCD24^hiB細胞中顯著上調(圖4B)。相反，來自Mb1^cre/+小鼠CD19⁺CD21^hiCD24^hiB細胞的負調節(jié)因子Id2表達上調，而Ahr^fl/-Mb1^cre/+小鼠補充丁酸后并沒有上調(圖4C)。與圖4C結果一致，在Mb1^cre/+小鼠CD19⁺CD21^hiCD24^hiB細胞中，丁酸鹽的添加降低了B細胞淋巴瘤6蛋白（Bcl6）和孤兒G蛋白偶聯(lián)受體（Gpr183）等位點的B細胞成熟基因的可及性 (圖4D)。ATAC-seq分析顯示，添加丁酸鹽不會改變AhR:ARNT特異性結合基序的可及性，但確實增加了與AHR:ARNT異二聚體(Esrra (雌激素受體α), Creb1, Rarb / Rarg（視黃酸受體））一起作用的轉錄因子在結合基序上的可及性（圖4E）。

為了研究補充丁酸鹽后AhR⁺CD19⁺CD21^hiCD24^hiB 細胞和AhR^-CD19⁺CD21^hiCD24^hiB細胞的表觀遺傳和轉錄譜變化是否改變它們的穩(wěn)定性和分化為IL-10感受態(tài)Bregs的能力，作者追蹤了從補充丁酸鹽和對照野生型或整體AhR^-/-同基因CD45.1受體WT小鼠分離而來的過繼轉移的CD19⁺CD21^hiCD24^hiB細胞命運。與對照WT小鼠相比，從補充丁酸鹽的WT小鼠中分離細胞時，轉移后回收了更多數(shù)量的供體CD45.2⁺CD19⁺CD21^hiCD24^hiB細胞，且更多的被轉移細胞為IL-10⁺ (圖5A-5D)。當從AhR^-/-小鼠中分離細胞時，丁酸鹽補充不會改變細胞的恢復率，且CD45.2⁺CD19⁺CD21^hiCD24^hiB細胞未能分化為IL-10⁺ Bregs（圖5A- 5D）。

丁酸鹽改變了微生物誘導的AhR配體可用性水平

微生物群是內源性AhR配體的重要貢獻者，腸道微生物群組成的變化會改變CD19⁺CD21^hiCD24^hiB細胞向功能抑制性Bregs的分化。作者首先在體外排除了丁酸鹽激活AhR的直接作用，并給予廣譜抗生素（ABX）處理過的小鼠強飼口服丁酸鹽，在ABX處理小鼠中丁酸鹽無法抑制關節(jié)炎(圖6A)。與未處理的對照組相比，從ABX處理小鼠中分離出的B細胞表達的IL-10mRNA更少，且在添加丁酸鹽后并無緩解(圖6B)，表明共生體微生物對Breg分化很重要，明確丁酸鹽抑制關節(jié)炎需要共生微生物。作者使用16S rDNA測序比較了空白、對照和丁酸鹽補充的關節(jié)炎小鼠的糞便中細菌門的相對豐度。補充丁酸鹽可引起關節(jié)炎小鼠糞便微生物群變化并與空白小鼠菌群更相似（圖6C）。相比對照組，補充丁酸的小鼠Allobaculum, Bifidobacterium和未分類的RhoDosprillaceae豐度增加（圖6D），其影響色氨酸衍生的代謝物產(chǎn)生，并與AhR激活的配體家族有關。作者檢測了對照和添加丁酸鹽后小鼠的糞便中色氨酸衍生代謝物，發(fā)現(xiàn)與對照組小鼠相比，補充丁酸鹽的糞便樣品中色氨酸、色胺、吲哚和L-犬尿氨酸的含量沒有差異(圖6E-6F)。血清素的主要代謝物5-HIAA(圖6G)顯著升高，犬尿氨酸衍生代謝物犬尿酸 (KYNA)水平顯著降低(圖6F)。

接下來，作者在體外用5-HIAA和KYNA刺激從小鼠中分離出的WT B細胞，發(fā)現(xiàn)不同于KYNA在B細胞中僅誘導Cyp1a1，5-HIAA增加了B細胞中Cyp1a1和IL-10的表達(圖7A)。更重要的是，在體內用這些AhR配體處理WT小鼠實驗表明，5-HIAA抑制關節(jié)炎進展并增加了離體B細胞中Cyp1a1和IL-10的轉錄(圖7B-7C)。為了研究AhR在5-HIAA免疫抑制中的作用，作者給Mb1^cre/+小鼠和Ahr^fl/-Mb1^cre/+小鼠強飼5-HIAA，發(fā)現(xiàn)5-HIAA在Mb1^cre/+小鼠中能夠抑制關節(jié)炎，但不能抑制Ahr^fl/-Mb1^cre/+小鼠關節(jié)炎(圖7D)。最后，為了探討5-HIAA在補充丁酸鹽后抑制關節(jié)炎能力中的作用，作者用色氨酸水解酶（TPH）抑制劑（L-對-氯苯丙氨酸（PCPA），可減少5-HIAA和血清素的生物合成）處理小鼠，發(fā)現(xiàn)與對照組小鼠相比，PCPA處理后的小鼠補充丁酸鹽失去了抑制關節(jié)炎的能力(圖7E)。綜上可知，補充丁酸鹽可增加5-HIAA的產(chǎn)生，它是B細胞中新鑒定的AhR配體，可介導體內補充丁酸鹽抑制關節(jié)炎的作用。

小結

本研究發(fā)現(xiàn)風濕性關節(jié)炎患者和關節(jié)炎小鼠模型中SCFAs丁酸鹽水平下降，補充丁酸鹽可通過增加5-羥色胺衍生的主要代謝物5-HIAA直接激活AhR⁺Breg功能和抑制成熟B細胞亞群分化來抑制關節(jié)炎小鼠模型的嚴重程度。5-HIAA是一種新發(fā)現(xiàn)的Bregs轉錄調節(jié)因子，它能夠激活芳基烴受體AhR，在B細胞中上調AhR依賴的基因和IL-10轉錄，并且在關節(jié)炎中具有免疫調節(jié)作用。因此，通過AhR激活來補充丁酸鹽可控制Breg功能同時抑制GC B細胞和漿母細胞的分化，可見補充丁酸鹽或將是緩解全身性自身免疫性疾病的一種可行療法。

參考文獻

Elizabeth C. Rosser, Claudia Mauri, et al. Microbiota-Derived Metabolites Suppress Arthritis by Amplifying Aryl-Hydrocarbon Receptor Activation in Regulatory B Cells. Cell Metabolism,2020. 31,1–15. https://doi.org/10.1016/j.cmet.2020.03.003.

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